СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ N,N'-ДИАЦЕТИЛ-L-ЦИСТИНА (NAC) И ДИМЕРА ГЛУТАТИОНА (GSSG) Российский патент 2025 года по МПК C01B17/98 C07C319/24 C07C323/59 

Изобретение относится к области технологии получения биологически активных соединений, которые можно использовать при производстве биологически активных добавок к пище, индивидуальных аминокислот и их производных, а именно синтезу дисульфидов N,N`-диацетил-L-цистина (NAC₂) и димера глутатиона (GSSG), обладающих потенциальной биологической активностью [Wallace T. J., Mahon J. J. Reactions of Thiols with Sulfoxides. II. Kinetics and Mechanistic Implications // J. Am. Chem. Soc. - 1964. - Vol. 86(19). - P. 4099-4103; Wallace T. J. Reactions of Thiols with Sulfoxides. I. Scope of the Reaction and Synthetic Applications // J. Am. Chem. Soc. - 1964. -Vol. 86(10). -P. 2018-2021]. Дисульфидная -S-S-связь участвует в таких важных процессах, как образование и стабилизация белка, а также передача импульсного сигнала в клетки.

Известен способ получения дисульфидов [Wallace T. J. Reactions of Thiols with Sulfoxides. I. Scope of the Reaction and Synthetic Applications // J. Am. Chem. Soc. - 1964. - Vol. 86(10). - P. 2018-2021], в котором синтезированы дисульфиды RSSR по -S-S-связи (с выходом 52-100%) из соответствующих тиолов RSH (R= 1-додекан-, 1-октадекан-, 1-гексадекан- (алифатическиетиолы); α-толуолтиол; 4-метилбензол-, 4-хлорбензол-, 2-нафталин, бензол-(ароматические тиолы)) при температуре 25-160°С в течение 3,5-24 часов путем взаимодействия с диметилсульфоксидом (ДМСО) (0,125-0,3 моль) по схеме реакции:

2RSH + R₂SO → R₂S + RSSR + H₂O

Полученные дисульфиды подвергали перекристаллизации в ацетоне. Однако в данном способе не получены NAC₂и GSSG.

Известен способ получения NAC₂ [Yamamoto K., Opina A., Sail D., Blackman B., Saito K., Brender J. R., Malinowski R. M., Seki T., Oshima N., Crooks D. R., Kishimoto Sh., Saida Yu., Otowa Y., Choyke P. L., Ardenkjaer-Larsen J. H., Mitchell J. B., Linehan W. M., Swenson R. E., Krishna M. C. Real-Time insightintoin vivo redox status utilizinghyperpolarized [1-¹³C] N-acetylcysteine // Scientific Reports. - 2021. -Vol. 11(12155). - P. 1-9] при участии глутатиона (GSH) и ДМСО в течение 16 часов при комнатной температуре. Порошки NAC (0,0257 г, 0,156 ммоль) и GSH(0,0962 г, 0,313 ммоль) смешивали, затем добавляли 10% раствор ДМСО в дистиллированной H₂O (1,0 мл). Полученную смесь осторожно встряхивали 5 минут до образования прозрачного раствора, затем перемешивали в течение 16 часов в атмосфере воздуха при комнатной температуре в соответствии с приведенной схемой:

Продукты реакции 1a-c были обнаружены методом жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии; основным продуктом реакции является 1b. Реакционную смесь разбавляли 20 мл деионизированной H₂O и лиофилизировали с получением твердого порошка. Разделение различных продуктов проводили на колонке Agilent PrepC18 со скоростью потока 50 мл/мин. Однако данный способ не позволяет получать NAC₂ и GSSG с выходом, достигающим 99%.

Известен способ [Boscutti G., Marchiò L., Ronconi L., Fregona D. Insightsin to the Reactivity of Gold-Dithiocarbamato Anticancer Agents toward Model Biomoleculesby Using Multinuclear NMR Spectroscopy // Chemistry - A european Journal. - 2013. - Vol. 19(40). - P. 13428-13436] получения NAC₂ реакцией окисления NAC комплексом золота [Au(III)Br₂(dtc-Sar-OCH₃)] (dtc: дитиокарбамат; Sar: саркозин(N-метилглицин)) (2) с участием ДМСО в течение 4 часов схеме:

В данном способе в качестве основных полученных продуктов с помощью ЯМР-спектроскопии были идентифицированы два вида различных соединений: NAC₂и ¹³C₄, ¹⁵N-обогащенный протонированный метилсаркозин. Однако данный способ не позволяет получать NAC₂ и GSSG с выходом, достигающим 99%; кроме того, в синтезе используются дорогостоящие реагенты.

Известен способ [Akimoto M., Yamamoto Y., Watanabe Sh., Yamaga H., Yoshida K., Wakabayashi K., Tahara Yu, Horie N., Fujimoto K., Kusakari K., Kamiya K., Kojima K., Kawakami T., Kojima H., Ono A., Kasahara T., Fujita M. Oxidation of a cysteine-derived nucleophilic reagent by dimethyl sulfoxide in the amino acid derivative reactivity assay // J. Appl.Toxicol. - 2020.-Vol. 40(6).-P. 843-854] получения димера N_fAC₂путем окисления N-(2-(1-нафтил)ацетил)-L-цистеина (N_fAC) 5% раствором ДМСО в ацетонитриле, что приводит к димеризации N_fAC, а также образуются диметилсульфид и H₂O:

Известный способ не позволяет получать NAC₂ и GSSG с выходом, достигающим 99%; продукт 1d был идентифицирован с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Таким образом, в настоящий момент из уровня техники не выявлены способы получения димеров NAC₂ и GSSG в качестве основного продукта при участии ДМСО с фиксированным выходом.

Технической задачей изобретения является получение димеров по -S-S-связи NAC₂и GSSG путем оптимизации условий проведения реакций окисления биологически активного тиола NAC и тиола GSH при участии ДМСО.

Технический результат достигается способом получения димеров NAC₂ и GSSG путем окисления биологически активного тиола NAC или тиола GSH с помощью диметилсульфоксида в водном растворе в мольном соотношении тиола NAC или тиола GSH к диметилсульфоксиду равным 2:1, при температуре 50-60°С в течение 3 часов.

Выход целевого продукта достигает 99%.

Реакция проходит по схеме:

Как следует из полученных экспериментальных данных, представленных в таблице, наибольший выход продуктов реакции NAC₂ (98%) и GSSG (99%) наблюдается в условиях проведения процесса при температуре 50-60°С, при выбранных мольных соотношениях реагентов NAC(GSH):ДМСО=2:1 в течение 3 часов (таблица).

Таблица

№
п/п Реагент Соотношение
реагент:ДМСО Температура, °С Время реакции, ч V (H₂O), мл Выход дисульфидов, % 1 NAC 1:11,5 25 24 9 76 2 NAC 1,9:1 25 3 9 86 3 NAC 2:0,5 25 24 1,6 53 4 NAC 2:0,9 25 3 9 55 5 NAC 2:1 25 24 2 84 6 NAC 2:1 25 24 9 82 7 NAC 2:1 25 3 9 87 8 NAC 2:1 30 3 9 90 9 NAC 2:1 30-40 3 9 93 10 NAC 2:1 50-60 3 9 98 11 NAC 2:1 70-80 3 9 97 12 NAC 2:1,1 25 3 9 90 13 NAC 2,1:1 25 3 9 89 14 GSH 1:11,9 25 24 9 65 15 GSH 2:1 10-15 3 9 75 16 GSH 2:1 0 3 9 45 17 GSH 2:1 25 24 9 96 18 GSH 2:1 25 24 2 91 19 GSH 2:1 25 24 6 80 20 GSH 2:1 30-40 3 9 98 21 GSH 2:1 50-60 3 9 99 22 GSH 2:1 70-80 3 9 98

Понижение температуры реакции до 25°С и ниже, а также повышение температуры более 79°С приводит к уменьшению выхода NAC₂ и GSSG (таблица). Так, например, понижение температуры реакции проводит к уменьшению выхода NAC₂и GSSG (табл. 1, строки 5-7,18) и появлению в реакционной среде побочного продукта - диметилсульфида (ДМС). При этом, время реакции также увеличивается до 24 часов.

Соотношение реагентов, вовлекаемых в процесс димеризации, также играет важную роль. Наибольший выход продуктов NAC₂ (98%) и GSSG (99%) достигается при мольных соотношениях реагентов NAC(GSH):ДМСО=2:1, тогда как даже небольшое изменение соотношения исходных компонентов приводит к значительному уменьшению выхода продуктов реакции (таблица, строки 3, 4, 12, 13).

Таким образом, полученный способ позволяет получать NAC₂ (98%) и GSSG (99%) в условиях проведения процесса при температуре 50-60°С, при мольных соотношениях реагентов NAC(GSH):ДМСО=2:1 в течение 3 часов.

Существенные отличия предлагаемого способа:

1. В предлагаемом способе в качестве исходных соединений используются NAC, GSH и ДМСО, а в качестве растворителя - дистиллированная вода.

В известных способах реакцию проводят при участии дополнительных дорогостоящих реагентов. Соотношение реагентов и выход NAC₂ и GSSG не установлены.

Предлагаемый способ обладает следующими преимуществами:

1. Способ позволяет получать NAC₂ и GSSG с выходом до 99%.

2. В ходе синтеза используются простые и недорогие реагенты.

3. Время реакции составляет 3 часа.

Способ поясняется следующими примерами:

Пример 1. В химический стакан объемом 25 мл, установленный на магнитной мешалке, помещали 200 мг NAC (1,23 ммоль), 47,9 мг ДМСО (0,61 ммоль) и дистиллированную воду (V=9 мл) в качестве растворителя. Соотношение исходных реагентов NAC:ДМСО = 2:1. Реакцию проводили при температуре 50-60°С при непрерывном перемешивании в течение 3 часов. После этого реакционную массу упаривали при комнатной температуре до образования твердого осадка. Получили мелкокристаллический порошок NAC₂ с выходом 98% (Таблица, строка 10).

Пример 2. В химический стакан объемом 25 мл, установленный на магнитной мешалке, помещали 200 мг GSH(0,65ммоль), 25,4 мг ДМСО (0,33 ммоль) и дистиллированную воду(V=9 мл) в качестве растворителя. Соотношение исходных реагентов GSH:ДМСО =2:1. Реакцию проводили при температуре 50-60°С при непрерывном перемешивании в течение 3 часов. После этого реакционную массу упаривали при комнатной температуре до образования твердого осадка. Получали белый мелкокристаллический порошок GSSG с выходом 99% (Таблица, строка 20).

Спектральные характеристики N,N`-диацетил-L-цистина:

ИК (KBr, см^-1): 3277 с. ν(OH) (СООН); 3105 ν(NH); 2964 сл., 2926 сл., 2856 сл. ν(CH₃, CH₂, CH);1724 c.ν(C=O) (СООН); 1639 о.с. ν(C=O)+δ(NH) (СО-NH); 1547 с.ν(C-N)_пепт.+δ(NH)+δ(CH); 1396 ср.,1377 ср.ν(C-O) (COOH)+δ(CH, CH₂); 1296 ср., 1231 ср., 1180 ср., 1126 ср.ν(C-N)+ν(C-С)+δ(ОH); 598 ср., 532 ср. δ(NH-CO)+δ(OH).

¹H ЯМР (D₂O, 298 K) δ_H (м.д.): 2.05 (с, 6H, 2CH₃), 3.01 (дд, ²J= 14,3 Гц, ³J= 8,7 Гц, 4H, 2СHH), 3.28 (дд, ²J= 14,3 Гц, ³J= 4,5 Гц, 4H, 2СHH), 4.7 (дд, ²J= 8,7 Гц, ³J= 4,5 Гц, 2H, 2CH₂CHCOOH).¹³C ЯМР (D₂O, 298 K) δ_C (м.д.):21.69 (C⁵, C^{5`</sup>), 38.58 (C<sup>1</sup><sub>,</sub> C<sup>1′</sup>), 51.81 (C<sup>2</sup>, C<sup>2′</sup>), 173.78 (C<sup>3</sup>, C<sup>3′</sup>), 174.16 (C<sup>4</sup>, C<sup>4`}).¹⁵N ЯМР (D₂O, 298 K) δ_N (м.д.): 123.221 (N, N`).

Элементный анализ для C₁₀H₁₆O₆N₂S₂. Вычислено, (%): C - 37.03, H - 4.97, N- 8.64. Найдено, (%): C - 37.43, H - 4.67, N- 8.29.

Спектральные характеристики димера глутатиона:

ИК (KBr, см^-1): 3392 ν(OH) (СООН); 3297, 3058, 2929ν(N-H)+ν(CH₂); 1647ν(C=O)(СООН), ν(C=O)+δ(NH) (СО-NH); 1539, 1528 ν(C-N)_пепт.+δ(NH)+δ(CH); 1417, 1339, 1312 ν(C-O)+δ(CH, CH₂); 1228 δ(NH)+δ(CH₂, CH); 1018, 952 δ(NH₂)+δ(CH)+ δ(OH); 656, 634 δ(CH₂, CH)+δ(OH); 568, 535 δ(NH)+δ(CH, CH₂).

¹H ЯМР (D₂O, 298 K) δ_H (м.д.): 2.1 (кв, ²J= 13,9 Гц, ³J= 7,1 Гц, 4H, 2СH(NH₂)CH₂CH₂), 2.44 (секстет, ²J= 15,9 Гц, ³J= 7,9 Гц, 4H, 2СH(NH₂)CH₂CHH), 2.49 (секстет, ²J= 15,6 Гц, ³J= 7,9 Гц, 4H, 2СH(NH₂)CH₂CHH), 2.89 (кв, ²J= 14,2 Гц, ³J= 9,4 Гц, 4H, 2CHH), 3.19 (дд, ²J= 14,3 Гц, ³J= 4,6 Гц, 4H, 2CHH), 3.78 (т, ²J= 12 Гц, ³J= 6,1 Гц, 2H, 2СH(NH₂)CH₂), 3.9 (с, 4H, 2NHCH₂), 4.67 (дд, ²J= 9,2 Гц, ³J= 4,6 Гц, 2H, NHCHCH₂). ¹³C ЯМР (D₂O, 298 K) δ_C (м.д.):25.91 (C⁸, C^{8`</sup>), 31.21 (C<sup>7</sup>, C<sup>7`}), 38.64 (C⁵, C^{5`</sup>), 42.37 (C<sup>2</sup>, C<sup>2`}), 52.52 (C⁴, C^{4`</sup>), 55.52 (C<sup>9</sup>, C<sup>9`}),172.36 (C³, C^{3`</sup>), 172.44 (C<sup>1</sup>, C<sup>1`}),174.27 (C⁶, C^{6`</sup>), 174.79 (C<sup>10</sup>, C<sup>10`}).¹⁵N ЯМР (D₂O, 298 K) δ_N (м.д.): 39.614 (CH(NH₂)CH₂, (CH(NH₂)CH₂)`), 111.687 (NHCH<sub>2</sub>, (NHCH<sub>2</sub>)`), 122.074 (NHCH(CH₂), (NHCH(CH₂))`).

Элементный анализ для C₂₀H₃₂O₁₂N₆S₂. Вычислено, (%): C - 39.21, H - 5.26, N- 13.72. Найдено, (%): C - 39.0, H - 5.32, N- 13.12.

Изобретение относится к способу получения димеров NAC₂ и GSSG, общей формулы

R-S-S-R, где

путем окисления биологически активного тиола NAC или тиола GSH с помощью диметилсульфоксида в водном растворе в мольном соотношении тиола NAC или тиола GSH к диметилсульфоксиду, равном 2:1, при температуре 50-60°С в течение 3 часов. Технический результат: разработан новый способ получения димеров NAC₂ и GSSG с выходом до 99%. 1 табл., 2 пр.

Способ получения димеров NAC₂ и GSSG, общей формулы

R-S-S-R, где

путем окисления биологически активного тиола NAC или тиола GSH с помощью диметилсульфоксида в водном растворе в мольном соотношении тиола NAC или тиола GSH к диметилсульфоксиду, равном 2:1, при температуре 50-60°С в течение 3 часов.