Изобретение относится к области медицинской химии, а именно к новому аминопроизводному фузидовой кислоты формулы (1), представляющему собой проп-2-ин-1-ил(2Z)-2-[(3β,4α,8α,11α,14β,16β)-16-(ацетилокси)-3-(бутиламино)-11-гидрокси-4,8,10,14-тетраметилгонан-17-илиден]-6-метилгепт-5-еноат, проявляющему антибактериальную активность в отношении Staphylococcus aureus (MRSA) и фунгицидную активность в отношении Cryptococcus neoformans.
Известны аминопроизводные фузидовой кислоты (ФК) и ее метилового эфира (2-5), содержащие в тритерпеновом каркасе при С-3 бутиламиновый заместитель (схема 1). Изучение противомикробной активности полученных соединений in vitro в отношении грамположительных (S. aureus) и грамотрицательных (E. coli, K. Pneumoniae, A. baumannii, P. aeruginosa) микроорганизмов, а также двух грибковых культур (C. albicans, C. neoformans) показало, что производное (2) проявляет антибактериальную активность в отношении S. aureus (MRSA), ингибируя на 95% рост данных бактерий в концентрации 32.0 мкг/мл, а соединения (3-5) неактивны в отношении исследуемых патогенов [Salimova E.V., Mozgovoj O.S., Efimova S.S., Ostroumova O.S., Parfenova L.V. «3-Amino-Substituted Analogues of Fusidic Acid as Membrane-Active Antibacterial Compounds». Membranes, 2023, V.13 (3), P. 309-332].
Схема 1.
Известны аминопроизводные метилового эфира ФК, содержащие в 3 положении молекулы фрагмент этилендиамина (6) и бензиламина (7), которые проявляют антибактериальную активность в отношении S. aureus (MRSA) и фунгицидную активность в отношении грибковой культуры C. neoformans, ингибируя > 73% рост данных патогенов при минимальной ингибирующей концентрации (MIC) 16 - 32 мкг/мл (схема 2) [Salimova E.V., Mozgovoj O.S., Efimova S.S., Ostroumova O.S., Parfenova L.V. «3-Amino-Substituted Analogues of Fusidic Acid as Membrane-Active Antibacterial Compounds». Membranes, 2023, V.13 (3), P. 309-332].
Схема 2.
Известен пропаргиловый эфир фузидовой кислоты (8), а также его азотсодержащие производные, содержащие гидразоновый (9) и индольные (10), (11) заместители в молекуле (схема 3). Изучение противомикробной активности полученных соединений in vitro в отношении грамположительных (S. aureus) и грамотрицательных (E. coli, K. Pneumoniae, A. baumannii, P. aeruginosa) микроорганизмов, а также двух грибковых культур (C. albicans, C. neoformans) показало, что пропаргиловый эфир (8) проявляет антибактериальную активность, ингибируя на 81% рост и размножение S. aureus (MRSA) в концентрации 0.25 мкг/мл, а производные (9-11) неактивны в отношении исследуемых патогенов [Салимова E.В., Парфенова Л.В. «Реакция Фишера в синтезе новых тритерпеновых индолов фузиданового ряда». ЖОрХ, 2022, Т. 58 (1), С. 36-50].
Схема 3.
Таким образом, аминопроизводное пропаргилового эфира ФК (1), а также его антибактериальная и фунгицидная активность в литературе не описаны. Задачей предлагаемого изобретения является синтез и изучение противомикробной активности in vitro проп-2-ин-1-ил (2Z)-2-[(3β,4α,8α,11α,14β,16β)-16-(ацетилокси)-3-(бутиламино)-11-гидрокси-4,8,10,14-тетраметилгонан-17-илиден]-6-метилгепт-5-еноата (1) в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов (S. aureus, E. coli, K. Pneumoniae, A. baumannii, P. aeruginosa), а также грибковых культур (C. albicans, C. neoformans) с последующей оценкой результатов биологических испытаний в соответствии с системой скрининга противомикробных веществ, принятой в CO-ADD (http://www.co-add.org).
Синтез заявленного соединения (1) осуществляли по реакции восстановительного аминирования, описанной в работе [Salimova E.V., Tret’yakova E.V., Parfenova L.V. «Synthesis and cytotoxic activity of 3-amino substituted fusidane triterpenoids». Med. Chem. Res., 2019, V.28(12), P. 2171-2183]. Дикетон пропаргилового эфира ФК (12) вовлекали во взаимодействие с 3 экв. н-бутиламина в среде сухого метанола в присутствии катализатора (i-PrO)4Ti с последующим восстановлением смеси 2 экв. NaBH4 (схема 4). В результате реакции получили аминопроизводное (1) с выходом 80%, которое представляло собой порошок светло-желтого цвета (т.пл. 152-154°С), 
+12.3° (c 0.95, CHCl3). Структура соединения (1) установлена с помощью 1D и 2D спектроскопии ЯМР 1Н и 13С и масс-спектрометрии MALDI TOF/TOF.
Схема 4.
Сущность изобретения поясняется следующими примерами.
Пример 1. Смесь дикетона (12) (0.28 г, 0.5 ммоль), изопропоксида титана (IV) (0.06 г, 0.15 ммоль) и н-бутиламина (0.11 г, 1.5 ммоль) в 5 мл абсолютного метанола перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре 2 часа. Реакционную массу охлаждали до -70°С и добавляли NaBH4 (0.04 г, 1.0 ммоль). Полученную смесь перемешивали в течение 30 мин при -70°С, после чего температуру постепенно повышали до комнатной и добавляли в реакционную массу 5 мл воды. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали метанолом. Маточный раствор концентрировали в вакууме, получая сырой амин, который очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя в качестве элюента смесь хлороформ-метанол в соотношении 20:1.
Спектральные характеристики проп-2-ин-1-ил (2Z)-2-[(3β,4α,8α,11α,14β,16β)-16-(ацетилокси)-3-(бутиламино)-11-гидрокси-4,8,10,14-тетраметилгонан-17-илиден]-6-метилгепт-5-еноата (1)1.
Спектр ЯМР 1Н (CDCl3), δ, м.д.: 0.95 (3H, с, H-18), 1.02 (3H, т, J = 7.5 Hz, H-4''), 1.04 (3H, д, J = 6.5 Hz, H-28), 1.07 (3H, с, H-19), 1.13-1.28 (1H, м, H-7b), 1.18-1.55 (1H, м, H-6b), 1.20-1.56 (2H, м, H-3''), 1.28-1.38 (1H, м, H-2''а), 1.35 (1H, д, J = 7.5 Hz, H-15b), 1.36 (3H, с, H-30), 1.43-1.80 (1H, м, H-2''b), 1.58-1.81 (1H, м, H-6a), 1.63 (3H, с, H-27), 1.65-1.75 (1H, м, H-4), 1.69 (3H, с, H-26), 1.72-1.83 (1H, м, H-5), 1.75-2.07 (2H, м, H-2), 1.76-1.86 (1H, м, H-7a), 1.78-1.95 (1H, м, H-12a), 1.88-1.98 (1H, м, H-1b), 1.97 (3H, с, O-C(O)CH3), 2.02-2.18 (2H, м, H-23), 2.06-2.27 (1H, м, H-15a), 2.12-2.22 (1H, м, H-1a), 2.22-2.44 (1H, м, H-12b), 2.39-2.49 (1H, м, H-22a), 2.55-2.65 (1H, м, H-22b), 2.73-2.87 (1H, м, H-3), 2.85-3.12 (2H, м, H-1''), 2.97 (1H, с, H-3''), 3.10 (1H, д, J = 10.5 Hz, H-13), 4.26-4.41 (1H, м, H-11), 4.65 (1H, д, J = 15.8 Hz, H-1''a), 4.74 (1H, д, J = 15.8 Hz, H-1''b), 5.14 (1H, т, J = 7.0 Hz, H-24), 5.84 (1H, д, J = 8.5 Hz, H-16).
Спектр ЯМР 13С (CDCl3), δ, м.д.: 12.55 (С-4''), 14.15 (С-28), 16.53 (С27), 16.67 (С18), 19.54 (С-3''), 21.04 (С6), 22.53 (С19), 22.77 (С30), 24.01 (С2), 24.57 (С26), 27.87 (С-2''), 27.91 (С23), 28.34 (С22), 31.57 (С7), 33.32 (С1), 34.90 (С4), 36.03 (С12), 36.77 (С10), 38.65 (С15), 39.12 (С8), 42.31 (С5), 43.87 (С-1''), 44.02 (С13), 48.44 (С14), 48.80 (С9), 48.68 (С3), 51.29 (С-1'), 66.77 (С11), 74.29 (С16), 75.01 (С-2'), 77.38 (С-3'), 122.65 (С24), 129.64 (С20), 132.32 (С25), 149.93 (С17), 169.11 (С21), 170.83 (ОСОСН3). Масс-спектр (MALDI TOF/TOF), m/z (Iотн., %): 632 (35.5) [М+Na]+, 648 (100) [M+K]+.
1Контроль реакции осуществляли методом ТСХ на пластинах Sorbfil (Сорбполимер, Краснодар, Россия), проявляли 10% раствором серной кислоты. Температура плавления определена на приборе РНМК 80/2617. Спектры ЯМР 1D (1Н, 13С) и 2D (COSY, NOESY, HSQC, HMBC) сняты на спектрометре Bruker Avance 500 (125.78 МГц для 13С и 500.17 МГц для 1Н) с использованием стандартных импульсных последовательностей фирмы Bruker, внутренний стандарт Me4Si, растворитель - CDCl3. Оптические углы измерены на поляриметре Perkin-Elmer 341. Масс-спектры MALDI TOF/TOF получены на спектрометре Bruker Autoflex TM III Smartbeam с использованием матрицы 3-(4-гидрокси-3,5-диметоксифенил)проп-2-еновой кислоты (синапиновая кислота).
Пример 2. Противомикробный скрининг соединения (1) проводили в рамках программы CO-ADD (Сообщество по открытию противомикробных препаратов, http://www.co-add.org) на пяти бактериальных штаммах: Escherichia coli (E. coli) ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) ATCC 700603, Acinetobacter baumannii (A. baumannii) ATCC 19606, Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ATCC 27853 и Staphylococcus aureus (S. aureus (MRSA)) ATCC 43300. Противогрибковую активность определяли на двух грибковых штаммах: Candida albicans (C. albicans) ATCC 90028 и Cryptococcus neoformans (C. neoformans) ATCC 208821.
Первичный скрининг противомикробной активности проводился путем тестов на ингибирование размножения клеток, используя образцы в одной (32 мкг/мл) концентрации. Аликвоту каждого образца в ДМСО помещали в 384-луночный планшет и обрабатывали соответствующей бактериальной культурой. Ингибирование роста бактерий определяли измерением поглощения при 600 нм (OD600) с использованием монохромного микропланшетного ридера Tecan M1000 Pro. Процент ингибирования роста рассчитывали для каждой лунки с использованием отрицательного контроля (только для среды) и положительного контроля (бактерии без ингибиторов) на той же пластинке. Все тесты продублированы. В случае если один или оба раза наблюдалось ингибирование роста ≥80%, соединение считалось активным.
При первичном скрининге было выявлено наличие противомикробной активности у проп-2-ин-1-ил (2Z)-2-[(3β,4α,8α,11α,14β,16β)-16-(ацетилокси)-3-(бутиламино)-11-гидрокси-4,8,10,14-тетраметилгонан-17-илиден]-6-метилгепт-5-еноата (1) в отношении культуры бактерий S. aureus (MRSA) и грибковой культуры C. neoformans (таблица 1).
Таблица 1. % Ингибирования роста микроорганизмов соединением (1)
в концентрации 32 мкг/мл.
99.2
3.6
8.5
18.3
28.9
3.5
101.5
1 S. aureus (MRSA); 2 E. coli; 3K. pneumonia; 4 P. aeruginosa; 5 A. baumannii;
6 C. albicans; 7 C. neoformans.
Для соединения (1) была определена минимальная ингибирующая концентрация в отношении вышеуказанных культур, а также изучена цитотоксическая активность (таблица 2).
Таблица 2. Антибактериальная, фунгицидная и цитотоксическая активности аминопроизводного (1).
0.25
16
32
**СС50 - концентрация исследуемого вещества, при которой происходит гибель 50% клеточной линии эмбриональных почек человека HEK293.
Минимальную ингибирующую концентрацию (MIC; мкг/мл) определяли в соответствии с рекомендациями Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI, https://clsi.org/), определяя самую низкую концентрацию, при которой было обнаружено полное ингибирование бактерий или грибов. Тесты проводились в двойном повторе. Соединения классифицировали как активные при MIC ≤ 16 мкг/мл или MIC ≤ 10 мкМ в любом повторе (n = 2 на разных планшетах).
Цитотоксическое действие (НЕК; СС50 (мкг/мл)) определяли на клеточной линии эмбриональных почек человека HEK293 путем определения концентрации, вызывающей гибель 50% клеток. Ингибирование роста клеток HEK293 определяли, измеряя флуоресценцию после добавления 5 мкл 25 мкг / мл резазурина (конечная концентрация 2.3 мкг/мл) и после инкубации в течение еще 3 ч при 37°C в 5 % CO2. Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием монохромного микропланшетного ридера Tecan M1000 Pro с использованием автоматического вычисления коэффициента усиления. Соединение считалось токсичным при CC50 ≤ 32 мкг / мл или CC50 ≤ 10 мкМ.
«Колистин» и «Ванкомицин» использованы в качестве положительных стандартов оценки бактериального ингибирования для грамотрицательных и грамположительных бактерий, соответственно. «Флуконазол» использован в качестве стандартного фунгицидного средства для C. albicans и C. neoformans. «Тамоксифен» использован в качестве положительного стандарта оценки цитотоксичности. Методики тестирования противомикробной, фунгицидной и цитотоксической активности in vitro соединений приведены на сайте http://www.co-add.org.
Анализ результатов противомикробного скрининга показал, что аминопроизводное пропаргилового эфира ФК (1) проявляло высокую антибактериальную активность, ингибируя рост и размножение >98% грамм-положительных бактерий Staphylococcus aureus (MRSA) в концентрации 0.25 мкг/мл, что превышает аналогичное действие препарата сравнения «Ванкомицина» в 4 раза. Кроме того, соединение (1) также обладало умеренным фунгицидным действием в отношении штамма C. neoformans, ингибируя рост данной грибковой культуры на 100% в концентрации 32 мкг/мл и проявляло низкую токсичность по отношению к клеточной линии НЕК293 при максимальной тестируемой концентрации 32 мкг/мл.
Таким образом, соединение (1) проявляет противомикробную активность в отношении патогенных микроорганизмов S. aureus (MRSA) и C. neoformans и обладает низкой токсичностью при максимально тестируемой концентрации.
Изобретение относится к проп-2-ин-1-ил(2Z)-2-[(3β,4α,8α,11α,14β,16β)-16-(ацетилокси)-3-(бутиламино)-11-гидрокси-4,8,10,14-тетраметилгонан-17-илиден]-6-метилгепт-5-еноату (1)
а также к применению аминопроизводного пропаргилового эфира фузидовой кислоты по п.1 в качестве средства с антимикробной активностью для борьбы с заболеваниями человека и животных, вызванными грамположительными бактериями Staphylococcus aureus (MRSA) и патогенными грибковыми культурами Cryptococcus neoformans. Технический результат: получено новое соединение, которое обладает низкой токсичностью при максимально тестируемой концентрации и проявляет антибактериальную активность в отношении Staphylococcus aureus (MRSA) и фунгицидную активность в отношении Cryptococcus neoformans. 2 н.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.
1. Проп-2-ин-1-ил(2Z)-2-[(3β,4α,8α,11α,14β,16β)-16-(ацетилокси)-3-(бутиламино)-11-гидрокси-4,8,10,14-тетраметилгонан-17-илиден]-6-метилгепт-5-еноат (1)
2. Применение аминопроизводного пропаргилового эфира фузидовой кислоты по п.1 в качестве средства с антимикробной активностью для борьбы с заболеваниями человека и животных, вызванными грамположительными бактериями Staphylococcus aureus (MRSA) и патогенными грибковыми культурами Cryptococcus neoformans.
