Применение 9-бензоил-8-гидрокси-6-(2-гидрокси-5-хлорфенил)-2-фенил-1-тиа-3,6-диазаспиро[4.4]нона-2,8-диен-4,7-диона в качестве противогрибкового средства в отношении Cryptococcus neoformans Российский патент 2023 года по МПК A61K31/429 C07D513/10 A61P31/10 

Изобретение относится к области органической химии и медицины, а именно к индивидуальному производному 1-тиа-3,6-диазаспиро[4.4]нонана 9-бензоил-8-гидрокси-6-(2-гидрокси-5-хлорфенил)-2-фенил-1-тиа-3,6-диазаспиро[4.4]нона-2,8-диен-4,7-диону, обладающему противогрибковой активностью в отношении Cryptococcus neoformans, которое может быть использовано в фармакологии, медицине и ветеринарии.

Микромицеты С. neoformans являются важными патогенами для человека, встречающимися в клинической практике. Они вызывают тяжелый менингоэнцефалит и диссеминированные инфекции преимущественно у больных СПИД и иммунодефицитами другого генеза [Кузикова И.Л., Медведева Н.Г. // Экология человека. 2021. №3. С. 4-14. DOI 10.33396 /1728-0869-2021-3-4-14].

Известен структурный аналог (2) заявляемого соединения (1) - 4-(4,5-дифенил-1-(тиазол-2-ил)-1H-имидазол-2-ил)-2-метоксифенол, проявляющий противогрибковый эффект в отношении С. neoformans (МНК₈₀=5 мкг/мл) [А. P. G. Nikalje, S. V. Tiwari, А. P. Sarkate, К. S. Karnik // Med. Chem. Res., 2018, Vol.27, PP. 592-606. DOI: 10.1007/s00044-017-2085-5]. Формула структурного аналога (2) представлена на схеме:

Задача настоящего изобретения состоит в разработке нового противогрибкового средства по отношению к микромицетам С.neoformans, не обладающего цитотоксической и гемолитической активностями.

Поставленная задача достигается исследованием 9-бензоил-8-гидрокси-6-(2-гидрокси-5-хлорфенил)-2-фенил-1-тиа-3,6-диазаспиро[4.4]нона-2,8-диен-4,7-диона на наличие противогрибковой активностью по отношению к грибам С. neoformans, а также на наличие у него цитотоксической и гемолитической активностей.

Заявляемое соединение (1) синтезируют взаимодействием 3-бензоил-8-хлорпирроло[2,1-с][1,4]бензоксазин-1,2,4-триона (2) с тиобензамидом в среде безводного толуола с последующим выделением целевого продукта известными методами [А.I. Kobelev, Е.Е. Stepanova, M.V. Dmitriev, E.S. Denislamova, A.N. Maslivets II Russ. J. Org. Chem., 2018, Vol.54, No. 5, PP. 766-770, DOI 10.1134/S 1070428018050159; A.H. Масливец, А.И. Кобелев, Е.Е. Степанова, С.Ю. Баландина // Патент РФ 2 707 195, 25.11.2019] по схеме:

Технический результат обнаружение нового соединения, обладающего противогрибковой активностью в отношении С. neoformans и не обладающего цитотоксической и гемолитической активностями.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение 9-бензоил-8-гидрокси-6-(2-гидрокси-5-хлорфенил)-2-фенил-1-тиа-3,6-диазаспиро[4.4]нона-2,8-диен-4,7-диона (1).

Суспензию 1.0 ммоль 3-бензоил-8-хлорпирроло[2,1-с][1,4]бензоксазин-1,2,4-триона (2) и 1.0 ммоль тиобензамида в 5 мл безводного толуола кипятили 10 мин, охлаждали до комнатной температуры, выпавший осадок соединения (1) отфильтровывали. Выход 91%, т.пл. 201-202°С (разл., толуол). Соединение (1) C₂₅H₁₅ClN₂O₅S.

Найдено, %: С 61.21; Н 3.17; N 5.61.

Вычислено, %: С 61.17; Н 3.08; N 5.71.

Соединение (1) - желтое высокоплавкое кристаллическое вещество, плавящиеся с разложением, легкорастворимые в ДМСО и ДМФА, растворимое в водно-спиртовых смесях, ацетоне, хлороформе, 1,2-дихлорэтане, 1,4-диоксане, этилацетате, труднорастворимое в ароматических углеводородах, четыреххлористом углероде, нерастворимое в алканах и воде, дающее положительную пробу (вишневое окрашивание) на наличие енольной гидроксильной группы со спиртовым раствором хлорида железа (III). Устойчиво при хранении в обычных условиях.

ИК спектр (РЕ Spectrum Two), v, см^-1: 3236 (О-Н), 1744, 1709 (С⁴=О, С⁷=О), 1669 (COPh). Спектр ЯМР ¹H (Bruker Avance III HD 400, 400 МГц, ДМСО-d₆) δ, м.д.: 6.95 м (2Н, Н_аром), 7.29 м (1Н, Н_аром), 7.50-7.65 м (5Н, Н_аром), 7.76-7.82 м (3Н, Н_аром.), 8.03 м (2Н, Н_аром.), 10.23 уш.с (ОН_фенол.). Спектр ЯМР ¹³С (Bruker Avance III HD 400, 100 МГц, ДМСО-d₆) δ, м.д.: 82.7 (C⁵), 116.8 (С⁹), 118.6, 121.4, 121.9, 128.2 (2С), 128.6 (2С), 128.7, 128.9 (2С), 129.6 (2С), 130.8, 131.2, 132.9, 136.1, 137.1, 153.9 (С_аром.), 154.1 (С⁷), 165.3 (С²), 187.3 (С⁴), 187.7 (COPh), 194.3 (С⁸).

Пример 2. Первичное исследование противомикробной и противогрибковой активностей 9-бензоил-8-гидрокси-6-(2-гидрокси-5-хлорфенил)-2-фенил-1-тиа-3,6-диазаспиро[4.4]нона-2,8-диен-4,7-диона (1) в концентрации 32 мкг/мл.

Противомикробный скрининг соединения (1) проводили по программе СО-ADD (The Community for Antimicrobial Drug Discovery, Институт молекулярной биологии Университета Квинсленда, Австралия), финансируемой Wellcome Trust (Великобритания) и Университетом Квинсленда (Австралия), на пяти бактериальных штаммах: Escherichia coli АТСС 25922 (Ее), Klebsiella pneumoniae АТСС 700603 (Kp), Acinetobacter baumannii АТСС 19606 (Ab), Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853 (Ра) и Staphylococcus aureus АТСС 43300 (Sa). Противогрибковую активность определяли там же на двух грибковых штаммах: Candida albicans АТСС 90028 (Са) и Cryptococcus neoformans var. grubii АТСС 208821 (Cn).

Первичный скрининг активности проводился путем тестов на ингибирование размножения клеток, используя образцы в одной концентрации (32 мкг/мл) в двух повторностях. Аликвоту каждого образца в ДМСО помещали в 384-луночный планшет и разводили соответствующей культурой микроорганизмов. Ингибирование роста микроорганизмов определяли спектрофотометрически при 600 нм на монохромном микропланшетном ридере Tecan М1000 Pro. Процент ингибирования роста рассчитывали для каждой лунки с использованием отрицательного контроля (только для среды) и положительного контроля (бактерии без ингибиторов) на том же планшете. В случае если один или оба раза наблюдалось ингибирование роста ≥80%, соединение считалось активным (Таблица 1).

При первичном скрининге было выявлено наличие фунгицидной активности у 9-бензоил-8-гидрокси-6-(2-гидрокси-5-хлорфенил)-2-фенил-1-тиа-3,6-диазаспиро[4.4]нона-2,8-диен-4,7-диона (1) в отношении грибковой культуры С. neoformans. Для соединения (1) была определена минимальная ингибирующая концентрация в отношении вышеуказанных культур, а также изучена цитотоксическая и гемолитическая активности.

Пример 3. Углубленное исследование противомикробной, противогрибковой, цитотоксической и гемолитической активностей 9-бензоил-8-гидрокси-6-(2-гидрокси-5-хлорфенил)-2-фенил-1-тиа-3,6-диазаспиро[4.4]нона-2,8-диен-4,7-диона (1) в диапазоне концентраций 0.250 32 мкг/мл.

Углубленные исследования соединения (1) также проводили по программе CO-ADD.

Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК₈₀, мкг/мл) устанавливали в соответствии с рекомендациями Института клинических и лабораторных стандартов (Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), США), определяя наименьшую концентрацию, при которой было обнаружено полное ингибирование бактерий или грибов. Скрининг проводился методом серийных двухкратных разведений. Образцы готовились в ДМСО в тестовой концентрации 32 мкг/мл. Все микроорганизмы культивировались на агаре Мюллера-Хинтона при 37°С в течение ночи. Образец каждой культуры затем разбавлялся в 40 раз и инкубировался при 37°С в течение 1,5-3 ч. Полученные культуры добавлялись в каждую лунку 384-луночного планшета, содержащую исследуемый образец (плотность клеток 5×10⁵ КОЕ/мл и общий объем 50 мкл). Все планшеты накрывались и инкубировались при 37°С в течение 18 ч без встряхивания. Ингибирование роста микроорганизмов определялось измерением поглощения при 600 нм с использованием монохромного микропланшетного ридера Tecan М1000 Pro. Процент ингибирования роста рассчитывался для каждой лунки с использованием отрицательного контроля (только для среды) и положительного контроля (бактерии без ингибиторов) на той же пластине. Значения ингибирования определялись с помощью модифицированных Z показателей, рассчитанных с использованием медианы и медианного абсолютного отклонения (MAD) образцов (без контроля) на той же пластине. Образцы с величиной ингибирования выше 80% и Z-оценкой выше 2,5 для обеих повторностей классифицировались как активные вещества. Тесты проводились в двух повторностях.

Цитотоксическое действие определяли на клеточной линии эмбриональных почек человека HEK293 (Hk) путем определения концентрации, вызывающей гибель 50% клеток (СС₅₀). Ингибирование роста клеток HEK293 определяли, измеряя флуоресценцию после добавления 5 мкл 25 мкг/мл резазурина (конечная концентрация 2.3 мкг/мл) и после инкубации в течение еще 3 ч при 37°С в 5% СО₂. Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием монохромного микропланшетного ридера Tecan M1000 Pro с использованием автоматического вычисления коэффициента усиления. Соединение считалось токсичным при СС₅₀ ≤ 32 мкг/мл или СС₅₀ ≤ 10 мкМ.

Гемолитическую активность (НС₁₀ - концентрация при 10% гемолизе) определяли путем измерения поглощения при 405 мм супернатанта - надосадочной жидкости, образованной после инкубации в течение 1 ч при 37°С планшетов, содержащих образцы соединений с добавленными к ним промытыми клетками крови человека (Hm), и последующего центрифугирования при 1000 об/мин в течение 10 мин. Абсорбцию измеряли с использованием монохромного микропланшетного ридера Tecan M1000 Pro. НС₁₀ > 32 мкг/мл (максимально испытанная концентрация) указывает на образцы без гемолитической активности. Образцы, обладающие гемолитической активностью, были охарактеризованы при НС₁₀ ≤ 32 мкг/мл.

«Колистин» и «Ванкомицин» были использованы в качестве положительных стандартов бактериального ингибирования для грамотрицательных и грамположительных бактерий, соответственно. «Флуконазол» использовали в качестве стандартного ингибитора гриба для С.albicans и С.neoformans. «Тамоксифен» использовали в качестве положительного стандарта цитотоксичности. «Мелиттин» использовали в качестве положительного гемолитического стандарта.

Методика тестирования противомикробной, фунгицидной, цитотоксической и гемолитической активности in vitro соединений приведена также на сайте http://www.coadd.org.

Образец 9-бензоил-8-гидрокси-6-(2-гидрокси-5-хлорфенил)-2-фенил-1-тиа-3,6-диазаспиро[4.4]нона-2,8-диен-4,7-диона (1) в концентрации ≤ 0.250 мкг/мл показал фунгицидную активность, ингибируя рост и размножение > 80% грибковой культуры С.neoformans, что свидетельствует о более сильном противогрибковом эффекте соединения (1), чем у препарата сравнения - «Флуконазола» (Таблица 2). Соединение (1) не проявляет гемолитическую и цитотоксическую активности даже в максимальной тестируемой концентрации > 32 мкг/мл (Таблица 2).

Таким образом, соединение (1) проявляет фунгицидную активность в отношении патогенной грибковой культуры С.neoformans и не обладает цитотоксическим и гемолитическим действием при максимально тестируемой концентрации.

Изобретение относится к применению 9-бензоил-8-гидрокси-6-(2-гидрокси-5-хлорфенил)-2-фенил-1-тиа-3,6-диазаспиро[4.4]нона-2,8-диен-4,7-диона (1) в качестве противогрибкового средства в отношении Cryptococcus neoformans. Технический результат: выраженная противогрибковая активность в отношении Cryptococcus neoformans при отсутствии цитотоксического и гемолитического действия, обеспеченная средством на основе 9-бензоил-8-гидрокси-6-(2-гидрокси-5-хлорфенил)-2-фенил-1-тиа-3,6-диазаспиро[4.4]нона-2,8-диен-4,7-диона. 2 табл., 3 пр.

Применение 9-бензоил-8-гидрокси-6-(2-гидрокси-5-хлорфенил)-2-фенил-1-тиа-3,6-диазаспиро[4.4]нона-2,8-диен-4,7-диона (1)

в качестве противогрибкового средства в отношении Cryptococcus neoformans.