Способ получения тимостерина А Советский патент 1983 года по МПК A61K38/22 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается производства биологически активных препара тов из сырья животного происхождения. Известен способ получения биологически активных веществ из тимуса теленка, стимулирующих созревание Т-лимфоцитов, включающий гомогенизацию измельченного сырья, вьщеление еистивной фракции, осаждение, очистку с помощью хроматографии и элюирование целевого продукта til . Однако известным способом выделяют биологически активные вещества, представляющие собой гетерогенные препараты. Известен способ получения тимостериг на А из тимуса телят, включаклций измельчение сырья, обработку физиологичес ким раствором, осаждение липид-белкового комплекса ацетоном, обработку полученного осадка раствором щелочи в кипящем спирте, последующую его экстра цию органическим растворителем, очистк полученного экстракта хроматографией на колонке и элюирование целевого продукта смесью органических растворите- v лей 2 . Однако известный способ не обеспечивает вьшеления целевого продукта с до- таточно высоким выходом и чистотой. Целью изобретения является повышение выхода и чистоты целевого продукта. Поставленная цель достигается тем, что в способе получения тимостерина А из тимуса телят, включающем измельчение сырья, обработку физиологическим раствором, осаждение Липид-белкового комплекса ацетоном, обработку полученного осадка раствором щелочи в кипящем спирте, последующую его экстракцию органическим растворителем, очистку полученного экстракта хроматографией на колонке и элюирование целевого продукта смесью органических растворителей, измельченный тимус животных инкубир тот в физиологическом растворе при в течение ЗО-6О мни, далее после осаждения липид-белкового компле са и его обработки кипящим раствором щелочи в этаноле проводят экстракито полученного осадка диэтиловым эфиром, а очистку экстракта осуществляют вначале ацетоном, затем недосадочную жидкость упаривают, остаток растворяют в бензоле, наносят на колонку с окисы алюминия и элюируют целевой продукт последовательно гексаном и затем гексан бензолом при cooTHOpieHHH (1:2) - (1:1) to бензол-днэтиловым эфиром при соотнош нии (90:95) - (10:5). Способ поясняется следующими примерами. Пример. Юкг массы, очищен ной от кровеносных сосудов тимуса телят и измельченной на гомогенизаторе, инкубируют с ЗО л-физиологического рас вора при в течение 60 мин. Полученную смесь фильтруют через капроновы фильтр и в фильтрат постепенно добавляют охлажденный ацетон при -SfC для осаждения липид-белкового комплекса (ЛБК). Из указанного количества сырья получается 9ОО г ЛБК, который омыляют 20%-ным этанольным раствором КОН при 78С в течение 1 ч и неомыляемую фракцию экстрагируют диэтиловым эфиром Для очистки экстракта от холестерина проводят кристаллизацию в ацетоне, после чего надосадочную жидкость неомыляе мой фракции упаривают в вакууме, затем растворяют в бензоле и наносят на колонку с окисью алюминия. Колонку промывают сначала гексаном для удаления сквалена, затем смесью гексана и бензол при соотношении 1:1 для удаления пигмен тов, а фракцию, содержащую целевой продукт, элюируют смесью бензол-диэтиловы эфир при соотношении 90:5. Контроль за составов каждой порции эяюатов осуществляют с помощью газового хроматографа марки CiiroKM 31. Фракцию, содержащую целевой продукт концентрируют и наносят на тонкий слой силикагеля с 13% гипса, разгоняют в бензоле. Целевой продукт находится в хроматографической зоне с Яо О,22, его элюируют диэтиловым эфиром. ГТосле отгонки растворителя получают желтоватые кристаллы, которые запаивают в ампулу. Выход целевого препарата 25 мг. П р и м е р 2. Ю кг измельченного тимуса телят инкубируют при 35°С в течение 30 мин. Из указанного количества сырЫя получают 900 г ЛБК. Осадок ЛБК подвергают шелочному гидролизу в 12% этанольном растворе КОК при 78 С в течение 2 ч. Неомьшяемые вещества ЛБК экстрагируют диэтиловым эфиром. Удаление основной массы холестерина неомыляемой фракции проводят кристаллизацией в ацетоне, после чего надосадочную жидкость концентрируют в вакууме и подвергают колоночной хроматографии на окиси алюминия Очистку от сквалена и пигментов проводят, как в примере 1, Фракцию,-содержащую целевой продукт эгаоируют смесью бензолгдиэтиловый эфир (90:10), которую после упаривания на роторном испарителе, хроматографируют на тонком слое силикагеля ЛС 5/40 с 10% гипса в бензоле. Целевой продукт, расположенный в зоне, характеризующейся R 0,25, элюируют из адсорбента ди этиловым эфиром. Вькод препарата 20мг. Примерз, 10 кг измельченного тимуса дикого северного оленя инкубируют при температуре в течение 40 мин в физиологическом растворе. Из указанного количества сырья получают 1,2 кг липкд-белкового комплекса (ЛБК). Cfcaдок ЛБК омыляют 15%-ным этанольным раствором КОН при температуре кипения этанола 78 С в течение 1,5 ч, а затем экстрагируют, как описано в примере 1. Очистку от холестерина и сквалена прово«дят так же, как и в примере 1. Удаление пигментов осуществляют на колонке элюированием смесью гексан-бензол в соотношении 2:1, а затем бензол-диэтиловым эфиром в соотношении 95:5. Выход продукта ЗО мг. Степень очистки целевого продукта контролируют на газожидкостном хроматографеС11Г01 31 при следующих стандартных условиях: колонка 1,8 м хб мм, заполненная носителем CliГО С1 ton -AWЗ)ЛCS, обработанным 3%-ным SiEicovi SE -30 (OaemapoC ЧССР), диаметр частиц 0,160-0,200 мм, газноситель-аргон, скорость 25 мм/мин. Рабочая температура колонки , температура инжектора 280 С. Скорость водорода 50 мл/мин, скорость воздуха 500мл/мин. Относительное время удерживания целевого продукта (по сравнению с холестерином) составляет 2,23. время удержиршния целевого продукта время удерживания холестерина Биологическая активность подтверхсдена экспериментально в опытах на животных у которых после введения препарата набпюдали стимуляцию иммунологического ответа. Инкубирование в течение 60 мин в среде с предлагаемым препаратом лим фэиитов периферической крови больных туберкулезом, ревматоидным артритом во станавливает их функциональную активность, процесс бласттрансформацин сти.мулируется, способность к роэеткообразованию возрастает до нормальных псжазателей, т.е. предлагаемый препарат из тимуса способен стимулировать дефектные лимфоциты. Заявляемый способ позволяет получит высокоочищенный препарат (85-90%) из сырья животного происхождения с выходом 2-3 мг из 1 кг тимуса. При упрощении технологии получения целевого продукта увеличивается его выход в 2 раза и обеспечивается более высокая степень очистки. Формула изобретения Способ получения тимостерина А из тимуса телят, включающий измельчение сырья, обработку физиологическим раствором, осаждение липид-белкового комплекса ацетоном, обработку полученного осадка расзсвором щелочи в кипящем спи те, последующую его экстракцию органическим растворителем, очистку полученного экстракта хроматографией на«колонке и элюирование целевого продукта смесью органических растворителей, о т л и 4 а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения выхода и чистоты целевого продукта, измельченный тимус животных инкубируют в 4изиологическом растворе при 35-37 С в течение ЗО-60 мин, далее после осаждения липкд-белкового комплекса и его о ботки кипящим раствором щелочи в этаноле проводят экстракцию полученного осадка диэтиловым эфиром, а очистку экстракта осуществляют вначале ацетоном, затем надосадочную жидкость упаривают, остаток растворяют ,в бензоле, наносят на колонку с окисью алюминия и элюируют целевой продукт последовательно гексаном и затем гексан-бензолом при соотнощении (1:2)-(1:1) и бензол-диэтиловым эфиром при соотнощении (90:95)-(10:5). Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Авторскоесвидетельство СССР № 706089, 1979, кл. А 61 К. 37/24. 2.Автореферат/канд. диссертации С. Н. Тихонова Исследование биологических свойств Стеринов. Билочков Ьй железы, Киев, 1975.