Способ получения антибиотика G-6302 Советский патент 1983 года по МПК C12P1/04 C12P1/04 C12R1/38 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения антибиотика G-6302. Цель изобретения - создание способа получения антибиотика G-6302. Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения анти биотика формулы uHi uKj f н f н 7-, HOit-t-CHj-tHi-t-1J-U-t-l J H OHO® штамм Pseudomonas acedophila G-6302 ATCC-31363 культивируют в аэробных условиях в питательной среде, содер жащей источники азота, углерода и минеральные соли, с последующим отделением культуральной жидкости и выделением целевого продукта. При этом, с целью повмшения выхо да целевого продукта, культивирование ведут на питательной среде, содержащей дополнительно метионин, ци теин, цистин, сульфат натрия или ти сульфат натрия. Используемый для осуиествления способа штамм Pseudomonas G-63D2 вы G-6302 делен из проб почвы, собранных в районе Ашигара Чимон-Гун, префектура Канагава, Япония, депонирован в институте Ферментации, Осака (1ГО) под номером I ГО 13774 и характеризуется следуняцими признаками. вультурапьно-морфологические признаки . По истечении 2-х дней на питательном скошенном агаре при 28 С клетки приобретают форму стержней диаметром 0,7-1,0 мк и длиной 0,7-3,5 мк. Подвижная с полярно расположенной жгутиковой зооспорой или полярно расположенным жгутиком, неполиморфна. Неспорулирующая: без накопления полибета-оксимасляной кислоты в качестве внутриклеточного углеродного запаса. Грам-отрицательная, кислотонеустойчивая. При выращивании при 28 С в течение 1-14 дней проявляет следующие свойства. На питательном агаре образует круглые колонии диаметром 1-3 мм с полным оформлением кромок по истечении 3-х дней; однородные: непрозрачные/ белые, растворимый пигмент отсутствует.

Питательный скошенный агар. Рост умеренный, нитевидной формы, непрозрачный, кремовой окраски.

Жидкая питательная среда. Мутное новообразование, практически без седиментации. По истечении 14 дней культивирования образует тонкую пле ку.

Питательный желатиновый столбик. Поверхностный рост, без разжижения.

Физиолого-биохимические свойства

Лакмусовое молоко не изменяет. Нитраты в нитриты не восстанавливает. Денитрификация отрицательная. Проба, на метиловый красный отрицательная. Проба Воджес-Прокауэра отр цательная. Сероводород образует (сл бо положительная реакция), Крахмал не гидролизует. Нитрат калия усваивает слабо, сульфат аммония усваив ет. Пигмент не образует, У.реаза положительная, оксидаза отрицательная каталаза положительная.

Растет при рН 4-8, оптимум рН 4,5-6,о; температуре от 2 До 31°С, оптимум роста при 25-30°С.

Аэроб. Окислительно-ферментативная проба - оксилительная.

На средах с сахарами слабо образует кислоту, газ не образует.

Ассимиляция источников углерода; хорошо усваивает арабинозу, D-ксилоЗУ, О-глюкозу D-маннозу, D-фруктозу, мальтозу, сахарозу, трегалозу, 0-сорбит, О-маннит, инозит, глицерин, альфа-метил-D-глюкозид, адонит раффинозу, цис-аконитат, цитрат, изоцитрат, глюконат, ацетат, фумара малат, тартрат, п-оксибензонат, о(.-аланин, бета-аланин, L-изолейцин сукцинат, 2-кетоглюконат.

Не усваивает лактозу, крахмал, мелибиозу, дульцит, L-валин.

Малонат не использует.

Фенилаланин не деаминирует.

Декарбоксилазная активность; аргинин - отрицательная, лизин - отрицательная, орнитин - отрицательная реакция.

Эскулин гидролизует.

Содержание гуанин-цитозина в дезоксирибонуклеиновой кислоте 59,5 мол.%.

Способ осуществляют следующим образом.

Для культивирования штамма G-630 могут быть использованы такие источники углерода, как глюкоза, сахароза, .мгшьтоза, отработанная меласса, глицерин, масла и жиры, органические кислоты. В качестве источника азота - органические и неорганические азотсодержашие соединения, например соевая мука, мука хлопковых семян, кукурузный экстракт, сухие дрожжи, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, мочевина, сульфат аммония

нитрат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония. Неорганические соли хлорид натрия, хлористый калий, карбонат кальция, сульфат магния, первичный кислый фосфат калия, вторич-ный кислый фосфат натрия. Выход антибиотика можно повысить путем добавления соединений серы - сульфат натрия, тиосульфаты, серосодержащие аминокислоты - цистеин, цистин, мегионин. Концентрации соединений серы поддерживают в питательной среде на уровне 0,01-1,0% (вес.об.), предпочтительно 0,02-0,5% (вес.об.). В питательную среду можно вводить соли тяжелых металлов, в частности сульфат двухвалентного железа, сульфат меди, а также витамин В , биотин. Культивирование в жидкой среде проводят в стационарных условиях при перемешивании, встряхивании в аэробных условиях. Температура культивирования от 15 до , рН питательной среды 4-8. Культивирование проводят в течение 8-168-4, предпочтительно от 24 до 144 ч.

Антибиотик может быть выделен обьачными способами, используемыми при выделении антибиотиков, а именно отделением клеток центрифугированием с последующей очисткой целевого продукта растворением в растворителе или осаждением из раствора, ионообменной хроматографией и др.

Пример. Клетки микроорганизма Pseudomonas acidophila G-6302 (FERM-P 4344, I ГО 13774 ,:7 ТСС-31363) выращенные на питательном скошенном агаре, используют для ионокулирования двух .ч. колб Сакагучи, содержавших по 500 об.ч. среды, которая включает в себя 1% глюкозы, 0,5% продукта полицептон, 0,5% мяс-ного экстракта, 0,5% хлористого натрия, величина рН 7,0, после чего каждую колбу инкубируют на возвратнопоступательном встряхивателе при 28°С в течение 48 ч. Конечную культуру используют в качестве посевной культуры.

Ферментер из нержавеющей стали емкостью 200 X 10 об. ч. заполняют 120 X 10 об.ч. среды, которая включает в себя 3% глицерина, 0,1% глюкозы, 0,5% полипептона, 0,5% мясного экстракта и 0,5% хлорида натрия, и после доведения величиры рН до 7,0 добавлением 30%-го водного раствора гидрата окиси натрия ее ртерилизуют водяным паром при 120с в течение 20 мин. Затем среду стерилизованного сосуда инокулируют указанной посевной культурой и инкубируют при 28 С с аэрацией при скорости подачи 120 х X 10 об.ч./мин скорости вращения мешалки 180 об/мин в течение 78 ч. .Конечный бульон подвергают центрифугированию с помошью сепараторной центрифуги с плавным рабочим режимо для отделения клеточной массы, в ре зультате получают 110 X 10 об.ч. . верхнего слоя жидкости. Величину рН этой жидкости доводят до .4,2 и пропускают, через колонку с 15 х 10 об активированного древесного угля. Ко лонку промывают 45 X 10 об.ч. 50%-го водного раствора ацетона, эл ат собирают в виде 10 х 10 об.ч. фракций. Отбирают фракции 2 и 3, пр являющие активность в отношении Pro teus mirabilis, добавляют 20 х 10 об . воды и смесь пропускают,через колой ку, заполненную 10 х. 10 об.ч. смолы Даукс (хлорионная форма). Колонку промывают 25-10об.ч. воды и элюиру ют 50 J 10 об.ч. 5%-го водного раств ра хлористого натрия. Отбирают акти ные фракции, доводят рН до 4,О и вновь пропускают через колонку с ак тивирЬванным древесным углем (8 .ч.) . Колонку промывают 2410 об.ч. воды и элюируют 20%-ным водным раствором метанола (объем/ /объем). Отбирают активные фракции и.концентрируют до 50 об.ч. при пониженном давлении. Затем добавляют 200 об.ч. ацетона, осадок отфильтровывают, промывают 50 об.ч. ацетона и 100 об.ч. диэтилового эфира и высушивают при пониженном давлении. Получают 12 частей сырого продукта. В500 об.ч. 0,01 М фосфатного буфера (рН 6,6) растворяют сырой продукт и раствор пропускают через колонку с 200 об.ч. продукта ДЕВЕ-сефадекс А-25, предварительно обработанного буфером. Колонку промывают 400 об. ч. того же буфера, а затем элюируют тем же буфером, в который предварительно добавляют 0,5% хлорис того натрия. Отбирают активные фракции, доводят рН до 3,21 н. НС1 и пропускают через колонку с 60 об,ч, активированного древесного угля. Колонку промывают 200 об.ч. воды и 100 об.ч. 20%-го (объем/объем) водного раствора метанола с последуквдим элюированием 50%-ным водным раствором ацетона (объем/объем). Отбирают активные фракции, концентрируют при пониженном давлении и растворяют в 5 об.ч. метанола. Добавляют 100 об.ч ацетона, смесь выдерживают на холоде Образовавшийся осадок отделяют фильтрованием, промывают диэтиловым эфиром и высушивают при пониженном давл нии пентоксидом фосфора при 40 С в течение 6 ч. Получают 3,8 частей порошка. Антибиотик обладает следующими Физико-химическими свойствами. Температура плавления 120°с (спекание), 1. (с разложением). Белый порсяиок. Молекулярный вес 400 + 20 (титрометрия). Найдено, %: С 34,83-35,45, Н 5,41- 5,24; N 13,22-13,73-, S 7,65-7,75, О 38,13+0,5. С Н N . S О- Н. О -(i 2.0 4- 9 2Спектрограмма ультра-фиолетового поглощения: только конечные частоты поглощения (никаких.характеристических поглощений при длине волны свыше 210 нм). Спектрограмма инфра-красного поглощения, доминантные пики (бромид калия), см : 3440 (си), 2920 (ср), 2850 (ср), 2600 (сл 1770 (си), 1650 (си) ,;i530 (си) ,.1458 (ср) , 1390 (ел) 1340 (ел), 1280 (пл), 1240 (си), 1210 (пл), 1180 (ср), 1118 (ел), 1043 (си), 792 (ел), 632 (ей), где си - сильное, ср - среднее, ел - слабое поглощение, пл - плечо. Удельное вращение (плоскости Ттоляризаи.ии) W 1 3+94°+10 (С-0,35, водр.). Спектрограмма ядерно-магнитного резонанеа (в диметилеульфокеиде, 100 мГц)5 3,31 ррт (S - определенный химический едвиг в направлении 0-СН,,) . Нераетворим в петролейном эфире, гексане, диэтиловом эфире, бензоле, этилацетате и хлороформе J умеренно растворим в этаноле, пиридине и ацетоне , растворим в метаноле и диметил сульфоксиде легко растворим в воде. Цветные реакции. Положительные с нингидрином и перманганатом калия, отрицательные - с хлоридом трехвалентного железа - феррицианидом калия, Сакагучи и Молиша) неопределенно положительные - реакция Эрлиха. Стоек в водном растворе в интервале величин рН 3-7 при 60с в течение 10 мин, нестоек при рН выше 8,5. Кислая реакция. Пример 2. В ферментационный сосуд из нержавеющей етал; емкостью об.ч. загружают 35 10об.ч. среды, которая содержит 3% глицерина, 0,1% глюкозы, 0,5% полипептона, 0,5% мясного экстракта, 0,5% хлористого натрия, затем величину рН этой среды доводят до 7,0 добавлением 30%го водного раствора гидрата окиси натрия и стерилизуют водяным паром при в течение 20 1ин. Затем среду инокулируют продуцентом. Инкубируют при температуре 2В°С с аэрацией при екороети подачи 3510 об. ч,/мин и екороети вращения мешалки 180 об/мин в течение 48 ч., получая вторичную поеевную культуру. Ферментационный еоеуд из нержавеющей стали емкоетью 2001П об.ч. заполняют 120010 об.ч. среды, которая включает 3% глицерина, 0,1% глюкозы, 0,5% полипептона, 0,5% мясного экстракта, 0,5% хлористого натрия и ОД% тиосульфата натрия, а после доведения рН до 7,0 добавлением 30%-го раствора гидрата окиси нат рия среду стерилизуют водяным паром при в течение 20 мин„ Затем среду инокулируют вторичной посевной культурой Инокулированную среду инкубируютпри 28°С при аэрации со скоростью подачи 1200,10 и скорости вращения мешалки 180 об/мин в те чение 90 Чр в результате получают 115010 обоЧ. культуральной жидкос ти.,, В нее добавляют 40-10 ч. продук та Хифло-Супр-Сел и фильтруют с помошью Лилот-пресса, Величину фильтр та доводят до 4 ,,2 добавлением 4н, м ггропускают через колонку с 120-10 оК,ч. активированного древес ного угля. Колонку промывают 30010 об,ч. воды, элюируют 50%-ным (объем/объем) водным раствором ацетона. Отбирают активные фракции и концентрируют при пониженном давлении для удаления ацетона. Полученны водный концентрат разбавляют 200 10 об,ч. воды и пропускают через .колонку, заполненную 5010 об.ч. продукта Дианон (хлорионная форма). Колонку про1 4ывают 1%-ным водным раствором хлористого натрия. Собирают активные фракции и концент рируют при пониженном давлении до конечного объема 100 об.ч., после чего добавляют 210- об,ч. метанола и выпавший в осадок хлористый натри отфильтровывают. После этого фил ьтрат концентрируют при пониженном давлении до объема 200 об.ч., а затем добавляют 2-10 об,ч, ацетона, выпавший Б осадок отделяют фильтрованием и высушивают Получают 757 ч сырого продг кта, 500 ч., сырого продукта растворяют в .ч воды, доводят величин - оН до 4,0 и адсорбируют в колонке на активиро ванном древесном угле (510 -.об.ч. ) Активный компонент элюируют по мето ду градиентного элюирования с испол зеванием Ю-10 об.ч,, воды и 10- 10 об,ч. водного раствора метанола (объем/объем) и элюат собирают l-io обоЧ. фракций. Активные фракции отбирают концентрируют при пониженном давлении для удаления метанола и доводят объем до бlO об.ч, добавлением 0,01 М фосфатного буфера (рН б|,0). Пробный раствор ,Г1ля адсорбции пропускают через колонку с 3-10 об.ч. продукта ДЕАБ-С фадекс , приготовлен ный согласно примеру 1, затем колон ку про м1ывают бЮ об,ч, того же бу ,фера, причем элюирование производят .тем самым буфером, в который добавляют 0,5% хлористого натрия, элюат собирают в виде 500 об.ч. фракций. Активную фракцию отбирают, доводят рН до 3 1н, НС1 и пропускают через колонку с 0,5-10 об.ч. активированного древесного угля. Колонку промывают 2-10 об.ч. воды и 210 об.ч, 20%-го водного раствора метанола (объем/объем), а затем элюируют 50%-ным водным раствором ацетона (объем/объем). Отбирают 200 об.ч. фракций. Активные фракции концентрируют при пониженном давлении и растворяют в 300 об.ч. метанола. Добавл яют 3 -10 об.ч. ацетона и 4 «Ю об.ч, диэтилового эфира и оставляют на холоде , выпавший осадок антибиотика отфильтровывают, промывают диэтиловым эфиром и высушивают при пониженном давлении над пятиокисью Фосфора. Выход 72 г. Данные элементарного анализа, %: С 35,45, Н 5,24, N 13,73, S 7,75 (вес/вес). Пример 3. В 90 об.ч. воды растворяют 4,0 ч. антибиотика G-6302 в свободной форме (по примерам 1 и 2} на холоде и добавляют в раствор приблизительно 9,0 об.ч. 1н. водного раствора NaOH. Затем добавляют дополнительное количество 1н. раствора NaOH до достижения величины-рН 6,5. Раствор высушивают вымораживанием, получают 4,2 мононатриевой соли G-6302 в виде белого порошка. Физико-химические свойства. Отсут.ствует определенная температура плавления (приобретает коричневую окрас- ку при 170С) . Белый порсшок. Молекулярный вес 438±5. Найдено, %: С 33,08, Н 5,07, N 12,73, S 7,33, Na 5,18. о Вычислено, %: С,33,03, Н 4,85, N 12,84, S 7,35, Na 5,27. Спектр ультрафиолетового поглощения: только конечные поглощения. Спектрограмма инфра-красного поглощения, доминантные пики (бромистый калий), см : 3430 (си), 3250 (пл), 3000 (ср), 1770 (си), 1640 (си), 1530 (си), 1450 (ел), 1405 (ел), 1343 (ел), ), 1245 (си), 1180 (ел), 1118 (ел), 1050 (ей), 820 (ел), 782 (ел), 632 (ей). Удельное вращение: Icil + 85° + t Ю(С-0,37, вода). Нерастворим в петролейном эфире, гекеане, диэтиловом эфире, бензоле, этилацетате, хлороформе и ацетоне; слабо раетворим в метаноле, этаноле и пиридинеJ раетворим в диметилсульфоксиде, легко растворим в воде. Цветные реакции. Положительные с нингидрином и перманганзтом калия, отрицательные - е хлоридом трехвалентного железа - феррицианидом калия, Сакагучи и Молиша-, неопределенно положительные - реакция Эрлиха. Стоек в водном растворе в интервале величин рН 3-7 при в течение 10 минутного нагревания; нестоек при величинах рН выше-8,5. Пример 4. Клетки микроорганизма G-6302, выращенного на питательном скхяяенном агаре, используют для инокулирования питательной среды (40 об.ч.), содержащей 1% глюкозы, .0,5% полипептона, 0,5% мясного экстракта и 0,5% хлористого натрия (рН 7,0), затем колбу .с инокулированной средой инкубируют на роторном встряхивателе при 28°С в течение 48 ч и получают посевную культуру. Конические колбы емкостью по 200 об.ч. заполняют 40 об.ч. среды, содержащей 3% глицерина, 1% глюкозы, 0,5% полипептона, 0,5% мясного экстракта и 0,5% хлористого натрия (рН 7,0), добавляют в каждую колбу 0,020,5% различных соединений серы с nq следующим инкубированием на роторном встряхивателе при 28с в течение 96 4 Дополнительное введение соединений серы позволяет повысить выход антибиотика (от 15 мкг/мл на обычной среде до 20-80 мкг/мп при добавлении эазличмых серосодержащих соединений) Пр и ме р 5. В 7,5 об.ч. холод ной водвл растворяют 1 ч. антибиотика в свободной форме, затем в смесь добавляют 17,5 об.ч. холодного метанола. Смесь оставляют на холоде на 28 ч Получают порошок, кристаллизованный в виде бесцветных кристаллов. КрисАнтимикробный спектр G-6302 и его натриевой соли

Микроорганизм

Esche г i ch i а coli N IHJ Escherichia coli T-7 Salmonella typhosa Boxhi11 58 Shigella flexnerl EW-10 Klebsiella pneunoniae DT Proteus vulgaris I FO 3988 Proteus morganic IFO 3168 Proteus mirabilis IFO 3849 Serratia marcescens tFO 12648 Pseudomonas aeruginosa U-31

Минимальная ингибирующая

22ЙЦ§ 1ЕЩи х 5 /5 0

G-6302 и G-6302 а

25 25

25 25

12,5

12,5 25 12,5 25

12,5 100 100 100 100 25 25 100 100 выше 100 Свыше 100 таллы отделяют, промывают небольшим количеством 80%-го (объем/объем) холодного водного раствора метанола, затем последовательно холодным метанолом и диэтиловым эфиром высушивают над-пятиокисью фосфора при пониженном давлении и температуре 60°С в течение б ч и добавляют 0,930 ч. кристаллов, полученного антибиотика. Полученные кристаллы имеют следующие физико-химические свойства.Температура плавления от 168 до 170с. Найдено, %: С 35,51-35,56, Н 5,615,61, N 12,93-12,93, S 7,45-7,59. N,50, СН,,ОН 0,5 , It с35,69; П 5,76; N 12,81, S 7,33. 23 Удельное вращение: , + 82 + + (C 1,0, в воде) . Инфра-красный спектр поглощения, доминантные пики (бромистый калий), 3440, 3355, 3000, 1780, 1660, 1650, 1538, 1265, 1245, 1220, 1038, 625. Спектрограмма ядерно-магнитного резонанса (в диметилсульфоксиде, 100 МГц); 3,31 ррт (SiBS) (определенный химический сдвиг в сторону 0-СН G-6302). tf 3,320 ppm (.)(определенный химический сдвиг в сторону -o-CHj метанола, который содержится в крис-. таллах).. Антибиотик G-6302 и его натриевая соль активны в отношении грамотрицательных и некоторых грамположительных бактерий (см. таблицу) .

Продолжение таблицы

Предлагаемый способ позволяет получить антибиотик, используемый для лечения заболеваний, вызванных перечисленными микроорганизмами, а также в качестве гермицида или дезинфицирующего средства.

Формула изобретения

г JH, 1

BOjt-U-(iHi-CHi-(i-N- i- i-S«-n,

fl 8 Л о

Заключающийся в том, что штамм Pseudononas acedophila G-6302 ATCC-3136 культивируют в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли, с последующим отделением культуральной жидкости и вьщелением целевого продукта.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, чтоf с целью повышения выхода целевого продукта, культивирование ведут на питательной среде, содержащей дополнительно метионин, цистеин, цистин. сулыЬат натрия или тиосульфат натрия.