Способ получения изомальтулозы Советский патент 1983 года по МПК C12P19/12 

О СП

o

№gff 4ff jy

ffff

/fanfye ayMr ftf ftuv/foi / % 2.Способ по п. 1, о т л и ч а щи и с я тем, что в качестве изомальтулъзуобразующего микроорганизма используют Erwlnia rhapontic штаммы NCPPB 1578, NCPPB 139, NCPPB 1739 или АТСС 2928i. 3.Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что изомальтулозу образующий микроорганизм фиксируют в виде целых клеток. Изобретение-относится к микробиологическому синтезу веществ и может быть использовано Для ферментативного получения изомальтулозы из сахарозы, которая может найти применение в пищевой промышленности. Известен способ получения изомаль тулозы из сахарозы микробиологическим способом при ферментации раствора, содержащего от 15 до Q% вес./ /вес. сахарозы. Образующуюся изомальтулозу выделяют фильтрованием и кристаллизуют fl J, Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемо му эффекту является способ получения изомальтулозы путем ферментативного превращения растворов сахаро зы с использованием изомальтулозуобразующих микроорганизмов, например Protominobacter rubrum или Serratia plymuthica, и последующего выделения и кристаллизации изомальтулозы. Для ферментации используют раствор с содержанием сухого вещества от 5 до 30%, предпочтительно от 20 до 27% причем сахароза составляет от 90 до 98 сухих веществ. Кроме Protominobacter rubrum и Serratfa plymuthlса могут быть использованы Serratfa marscescens firwmia carotovora или Leuconostoc mesenterofdes в качестве изомальтулозуобразующего микроорганизма 2. Недостатками указанных способов являются необходимость использования растворов сахарозы с концентрацией ниже tO i. предпочтительно около 25), недостаточно высокая продуктивность изомальтулозуобразующих микроорганизмов, а также протекание 10 Ю- 6 k. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что для фиксации используют растворимый экстракт целых. или дробленых клеток изомальтулозу образующего микроорганизма, 5. Способ по п. 1, о т л и чающийся тем, что в качестве геля используют альгинатный гель. побочных процессов при аэробной ферментации микроорганизмов, которые приводят к образованию веществ, загрязняющих изомальтулозу. Цель изобретения - повышение стабильности и продуктивности изомальтулозуобразующих микроорганизмов. Поставленная цель достигается согласно способу получения изомальтулозы путем ферментативного преьращени я растворов сахарозы с использованием изомальтулозуобрёзующих микро.организмов и последующего выделения и кристаллизации изомальтулозы, изомальтулозуобразующие микроорганизмы фиксируют путем включения в гель и используют для получения изомальтулозы из растворов, содержащих 40-55% вес/ /об. сахарозы. Кроме того, в качестве изомальТулозуобразующего микроорганизма используют Erwfnia rhaponticf штамма NCPpB 1578, NCPPB 139, NCPPB 1739 или АТСС 29284 Изомальтулозуобразующий микроорганизм фиксируют в виде целых клеток. Для фиксации используют растворимый экстракт целых или дробленых клеток изомальтулозуобразующего микроорганизма . В качестве геля используют альгинатный гель. В предлагаемом способе используют иммобилизацию для закрепления фермента или ферментов, образующих ферменативную систему, участвующую в превращении сахарозы в изомальтулозу. Можно использовать ферментативную истему, экстрагированную .из изомальулозуобразующего микроорганизма, на;пример или дробленые клетки мик роорганизма, при этом клетки служат носителем для ферментативной системы. Некоторое деление целых клеток может происходить после иммобилизации, но желательно, чтобы способ иммобилизации и другие параметры процесса были выбраны таким образом, чтобы деление отсутствовало или было минимальным. Для иммобилизации ферментной системы могут быть использованы различные способы, но наиболее удобным является задержание в геле, поскольку этот способ пригоден для иммобилизации ферментативно -активного экстракта клеток, а также целых или дробленых клеток. Подходящие материалы ДЛЯ геля включают альгинат полиакрил амид, агар, смесь ксантановой смолы (смолы лжеакации, каппа-частицы карагенана или смесь каппатчастиц карагенана), смолы лжеакации, коллаген или ацетатцеллюлозу. Из этих материалов альгинатный гель, в частности гель альгината кальция, дает наилучшие результаты. Можно использовать другие альгинатные гели, например те, которые образуются с другими металлами Ц группы. Гель альгината кальция характеризуется высокой скоростью проникающей диффузии сахарозы и низкой скоростью утечки наружу целых клеток и белка. . ,Дополнительным преимуществом является исключительная стабильность изомальтулозуобразующей активности у фик сированных целых клеток. Полупериод активности клеток, задержанных в геле альгината кальция, достигает 10000 ч, причем-8500 ч является типич ной величиной, в то время как самый длительный полупериод в сравнимых условиях при других способах иммобилизации составляет ниже 1000 ч. Кроме того, иммобилизация в альгантном геле не приводит -к существенной потере активности. Для иммобилизации ферментативной системы самой по себе, либо в целых или в дробленых клетках) в альгантном геле смешивают ферментативную систему с водным раствором растворимого альгината, например альгината натрия. Оптимальной процедурой является суспендирование целых клеток с растворимым альгинатом. Концентрация клеток составляет 1-90% влажного веса к объему, более оптимально 10-40%, еще лучше 20%. Наиболее приемлемые концентрации растворимого альгината для использования с целыми клетками или с другими видами ферментативной систему составляют 1-10% (вес./об.), более п|редпочтительно 5% (. вес./об. Полученную, альгинатную смесь дозируют в раствор соли металла,- с которой растворимый альгинат образует гель о Если гелем является альгинат кальция, то подходящие соли включают хлористый кальций концентрацией 0,011,0 М, предпочтительно 0,05-0,5 М или 0,1 М. Температура раствора соли металла при дозировании , предпочтительно около ,- раствор перемешивают. Стабильность фиксированной ферментативной системы увеличивается, если раствор соли мetaлла содержит также некоторое количество растворенной сахарозы, например (вес./об. сахарозы, предпочтительно 20%. При дозировании суспензии или другой альгинатной смеси в виде отдельных капель можно получить сферические гранулы геля, удерживащего ферментативную систему. Размер гранул может изменяться, но для легкости обращения и для обеспечения высокой эффективности переноса массы при использовании, желательно использовать гранулы диаметром 3-5 мм. Однако размер и форма имеют мало значения. Можно фиксировать ферментативную систему в блоке геля (который для использования навивак т на форму или нарезают на части), либо в микроволокнистых частицах (при использовании условий высокого градиента при дозировании альгинатной смеси). Используют и другие гели. Каппа-карагенан или смесь каппакарагенана сиолы лжеакации используют в таком же способе:, который использовали для альгината, за тем исключением, что раствор, в который экструдировали клеточную суспензию,представляет собой смесь IM CaCI и 1 М КС1 при . Агар получают путем кипячения 5% (вес./об.) агара в деионизованйой воде, охлаждают полученный гель до добавляют суспензию клеток и экструдируют полученную суспензию по каплям в ледяную воду. ,5 Смесь ксантана/смолы лжеакации полумают с noMoutbro методики, что и для агара, но смолу нагревают до , а гель перед добавлением клеток охлаждают до 60° С. Используют полиакриламид по способу Ч иба ты (Chibate et a1. (Method in Enzymology, , 1976, p. 739). Для иммобилизации целых или дроб леных клеток изомальтулозупродуциру ющего микроорганизма можно использо вать другие способы иммобилизации. Например, клетки можно физически ад сорбировать на инертном носителе;. ковалентно связать их с инертным но сителем; агрегировать с помощью поперечно-сшивающего реагента, при этих способах, однако,сохранение ак тивности и стабильность активности ниже. Вместе с тем эти способы иммобилизации обладают другими преиму ществами. Так, при адсорбции клеток на целлюлозе жидкость, полученная после превращения, кристально прозрачная, что свидетельствует о том, что все примеси адсорбированы ДЕАЁцеллюлозой. Иммобилизация дробленых клеток или растворенных экстрактов ферментативной системы позволяет полность избежать клеточного деления, происходящего по время их использования, благодаря чему устраняется рас трескивание гранул и блокировка пор что иногда происходит при делении фиксированных целых клеток внутри гранул геля альгината кальция. Более того, при фиксировании дробленых клеток или растворенных экстрактбз начальная активность является более высокой, что показывает отсутствие неповрежденных мембран стенок клетки, которые могут действовать как барьер, препятствующий диффузии сахарозы или изомальтулозы. Дробление можно осуществить с помощью шаровой мельницы или другой обработкой целых клеток. Источником ферментативной системы, используемой для иммобилизации, является изомальтулозупродуцирующий микроорганизм рода Erwinla. Мож но использовать бактерии других родов - Servatia plymuthlca или Ргоtaminobacter rubrum, но первый из названных возможно является патогенным для человека, а последний склонен продуцировать нежелательный красный пигмент с малым моле566кулярным весом. Можно использовать мутанты бактерий природного происхождения. Из штаммов, принадлежащих роду Erwinla, желательны штаммы E.phapontici, которые хранятся в Британской Национальюй коллекции растительных патогенных бактерий по регистрационным номерам Л/ СРВ 1578, N СРРВ 139 и N СРРВ 1739. Щтамм«СРРВ 1578 хранится в Американской коллекции типов культур под регистрационными номерами АТСС 29283., . Штаммы N СРРВ 1578, 139 и 1739 ЯВЛЯЮТСЯ наиболее перспективными, поскольку обладают более высокой специфичностью продуцирования, большей первоначальной активностью и стабильностью по сравнению с другими штаммами Erwinla или с другими штаммами других родов. Способ проводят как непрерывный процесс путем загрузки зафиксированной ферментативной системы в колонну и пропускания субстрата сахарозы в виде раствора через колонку или несколько колонок, установленных параллельно, например, на карусели. Размер колонки больше 20 мл. При обйчном превращении сахарозы в изомальтулозу образуется некоторое количество двуокиси углерода. При использовании зафиксированных целых клеток легче выводить этот углекислый газ, если жидкость пропускают через колонку вверх. Пропускание жидкости вверх способствует ожижению слоя -зафиксированной ферментативной системы и позволяет избежать уплотнения, которое возможно при пропускании жидкости вниз. В качестве субстрата используют раствор сахарозы,содержащий не менее 301 предпочтительно не менее 40|и лучше всего не менее .об. сахарозы. Стабильность ( измеряемая в(эеменем полупериода жизни ферментативной системы синтеза изомальтулозы в зафиксированных клетках увеличивается с увеличением концентрации сахарозы, аналогично увеличивается концентрация изомальтулозы в конвертированной жидкости. На фиг. 1 изображен график зависимости стабильности зафиксированных клеток от концентрации раствора сахарозы; на фиг. 2 - влияние концентрации сахарозы на продуктивность зафиксированных клеток. Данные получены при использовании гранул альгината кальция с зафиксированным штаммоя E.rhapontici NCPPB 1739. flpH увеличении концентрации сахарозы выше 30-ЛО стабильность и продуктивность существенно возрастают, что обусловлено главным образом свой ством зафиксированной изомальтулозуобразующей ферментативной системы, а не особенностями способа фиксировани Способ иммобилизации с использование альгината кальция в этом случае дает лучшую стабильность. Кроме того, высокая концентрация сахарозы способствует ингибированию деления зафиксированных клеток и пре отвращает микробное заражение, облегчает выделение продукта и уменьшает объем обрабатываемой жидкости. Верхний предел вязкости раствора заключен от 100 до 1000 сП, как правило около 500 сП. Для способа с использованием клеток, зафиксированных в гранулах геля альгината кальция, концентрация сахарозы в исходном материале состав ляет около 55 (вес./об.). Субстрат не обязательно должен быть раствором чистой сахарозы, вмес то последней можно включить в раствор до 15 (об./об.) мелассы или использовать материал, получаемый на. сахарном заводе, или родственный сироп, причем эт два типа примесей получают при обычном рафинировании сахара., Превращение сахарозы в изомальтулозу проводят при 15 АОС, более ,предпочтительно при 20-35 С, особенно приемлема температура около 30 С; рН раствора сахарозы наиболее предпочтительно около 7. Превращение в изомальтулозу обычно приводит к за кислению среды, но на практике обычно нет необходимости включать стадии для поддержания значения рН в пределах от 5 до 9. В любом случае образование кислоты обычно уменьшается при увеличении концентрации субстрата. . Способ проводят так, чтобы осуществлялось в контролируемой степени превращение сахарозы в изомальтулозу и в сопровождающие продукты. При увеличении времени пребывания сахарозы в контакте с зафиксированной ферментативной системой увеличивается степень превращения до практи ческого максимума от 85 до 100% сахарозы преврацается в продукты . Однако максимальная продуктивность необязательно достигается при самой высокой степени превращения,потому что большая пропускная спсГсобность и более высокая активность, полученные благодаря меньшему времени пребывания, могут ксмпенсировать потери при работе не с максимальным превращением. Таким образом, максимальная про- . дуктивность достигается при работе . не с максимальным превращением, а обычно при превращении в продукты от 70 ДО 95. Для гранул альгината кальция с зафиксированными клетками Erwinia обычно наблюдается максимум продуктивности, если работают при превращении от 80 до 90. На фиг. 3 изображен график зависимости продуктивности зафиксированных клеток от исходного процента превращения (т.е. процент превращения проэкстрапрлирован назад к нулевому времени). Данные получены при использовании гранул альгината кальция с зафиксированными клетками E.rhaponitici N СРРВ 1739. Имеется заметный максимум продуктивности вблизи значения от 85 до 90% степени преварщения сахарозы в изомальтулозу и в сопутствующие продукты. Степень превращения сахарозы в i продукты значительно влияет на стабильность изомальтулозуобразующей ферментативной системы зафиксированных клеток. Стабильность может экспоненциально возрастать при увеличении степени превращения концентрированного раствора сахарозы. На фиг, А изображен график.зависимости полупериода жизни зафиксированных клеток от исходного процента превращения ( при 55%-м превращении раствора сахарозы). Данные получены при использовании гранул альгината кальция с зафиксированными клетками E.rhapontici N СРРВ 1739. Стабильность возрастает экспоненциально до значения примерно 8500 ч при 90%-м превращении. После получения изомальтулозы ее можно закристаллизовать либо очистить другим образом. Для пищевых и родственных продуктов можно использовать закристаллизованную изомальтулозу, которая не обязательно должна быть чистой, в некоторых случаях можно использовать незакристаллизованный продукт, соде жащий примеси. Пример 1. Клетки из культу ры Erwinia rhapontici N СРРВ 1578, АТСС 29283) разбавляют 10 мл фосфат ного буфера. 0,10 мл полученной сус пензии используют для посева на 200 питательной среды в стериллиэованны конических колбах с перегородками ем костью 500 мл. Состав среды указан в табл. 1. Таблица 1 Количество Компонент (г/л дистиллированной воды) Сахароза Пептон ( переваренный казеин) Мясной экстракт Колбы с посевами трясут со скоро тью 120 колебаний в мин при 30 С в течение 70 ч, затем собирают биомас су. Клетки собирают в стационарной фазе роста, но можно собирать в логарифмической фазе роста или в фазе смерти. Клетки центрифугируют при 15000 10 мин при 30°С, по |учают примерно 1 г утрамбованных влажных клеток на 100 мл среды (если нужно обработать большие объемы инкулируемой среды, используют центрифужный ротор непрерывного действия, через который прокачивают среду со скоростью 100 мл/мин). Собранные утрамбованные клетки суспендируют в растворе альгината натрия 5% (сухого вес./об,J в деионизированной воде с тем, чтобы получить 20% (влажн. вес./об. суспензию клеток ( вес клеток в граммах называют влажным весом (влажн. приблизительно перевести в сухой вес можно путем деления на 5. Активности клеток выражены в расчете на грам влажных клеток). Клеточную суспензию .экструдируют по каплям с высоты 10 см в перемешиваемый раствор хлористого кальция С 0,1 М) с температурой 30 С, содержащий 20 (вес./об. сахарозы, которая служит для стабилизации изомальтулозуобразующей активности клеток. Полученные гранулы перемешивают 1 ч, затем помещают в колонку (30 см высоты, 5 см в диаметре ), снабженную рубашкой охлаждения. Затем готовят раствор сахарозы 55% (вес./об.) в деионизованной воде и доводят рН до 7,0 с помощью 1,0 М МаОН. Сахарный раствор прокачивают вверх через колонку при . При скорости потока сахарозы примерно 0,01 объемов пустой колонки/ч превращение сахарозы в изомальтулозу и другие продукты достигает равновесия. Равновесное состояние достигается через 24 ч, К этому времени активность зафиксированных клеток составляет примерно 0,2 г продукта /г.влажн. клеток/ч. Стабильность клеток, выраженная как полупериод , составляет примерно 1 год. Когда скорость потока сахарозы увеличивают так, что превраидение снижается до 80, активность составляет примерно,0,325 г продукта/г влажн.клеток/ч. Собирают элюат колонки, выпаривают примерно до 70 ( вес./об.) , при , затем дают остыть, либо принудительно охлаждают при перемешивании, получая при этом маленькие белые кристаллы. Кристаллы можно выделить быстрее путем затравки охлажденного раствора небольшим количеством сухой изомальтулозы. Кристаллы собирают фильтрованием или центрифугированием и высушивают при и 700 мм рт.ст. в вакуумной печи. Продукт подвергают анализу, а затем испытывают. Кристаллы содержат изомвльтулозы, при этом одна молекула кристаллизационной воды приходится на молекулу иэомальтулозы, остальное составляют другие сахара. Трехкратная перекристаллизация дает чистую изомальтулозу. Если субстрат на 80 превращают в изомальтулозу и сопутствующие продукты, получают 88 г кристаллического продукта на 100 г сахарозного субстрата, а продуктивность колонки составляет 0,30 т сухого кристаллического продукта/объем колонки/ год. Во время рабочего использования количество жизнеспособных клеток из зафиксированных клеток быстро уменьшается: количество жизнеспособных клеток достигает нуля примерно че рез 500 ч рабочего использования. После этого периода не остается жизнеспособных клеток и не видно инволюциойных форм клеток. Несмотря на

1110

сравнительно быструю потерю жизнеспособности , изомальтулЬзуобра зующая активность зафиксированных клеток спадает не:зависино и намного медленнее с временем полураспада 35 дня.

Это показывает, что жизнеспрсобные клетки не нужны для образования изомальтулозы, и, что возможно имеется единственный стабильный фермент, который превращает сахарозу в изомальтулозу, для которого не требуется рециркулирование кофакторов или непрерывная регенерация источников энергии. Это подтвёрждается опытом, когда в качестве субстрата используют в 55%-ной (вес./объем) сахарозе 0,1 г/л хлорамфеникола, который ингибирует синтез белка. Активность синтеза изомальтулозы не изменяется, но деление клеток прекращается, даже при добавлен|/1и питательных веществ.

Можно вызвать новый рост клеток Erwinia на месте посредством подачи питательных веществ в виде свежей стерильной среды даже при использовании их в колонке непрерывно в течение долгого времени; изомальтулозуобразующая активность падает о небольшой доли от ее первоначального значения. 8 этих опытах среду прокачи вают вверх через колонку со скоростью 0,01 сзбъемов пустой колонки/ч. Значительные количества СП выделяются при этом клетками, зафиксированными в гранулах, значение рН отработанной среды, вымываемой из колонки, падает до ,, наблюдается увеличение числа жизнеспособных клеток, как в гранулах так и в отработанной среде, причем анализ азота, как отработанной среды, так и гранул клеток, показал, что происходит рост клеток. После возврата назад к сахарозе в качестве субстрата изональтулозуобразующая активность гранул возрастает в некоторых случаях до уровней, превышающих первоначальную активность . Нет доказательств образования фермента в исходных клетках, но есть факт, что регенерация вызвана исключительно ростом к-леток. Степень восстановления активности гранул пропорциональ на числу жизнеспособных клеток, оставшихся непосредственно перед добавлением питательных веществ, и никакого восстановления активности не наблюдают в гранулах, которые использовали в течение столь длительных пе05612

риодов времени, что все зафиксированные клетки сделались жизнеспособными (500 ч/:

После рабочего использования регенерированных клеток в течение последующего периода активность колонки можно активировать аналогичным способом не менее 3-х раз. Возможность регенерации колонок с зафиксированными клетками обеспечивает теоретически бесконечную стабильность колонки и говорит о том, что возраст зафиксированных клеток не зависит от пропускной способности субстрата.

$ Вместо подачи питательных веществ непосредственно после использования гранул в течение некоторого периода времени питательную среду можно подать в колонку непосредственно после фиксирования. В этих опытах медленный рост клеток Erwinia происходит на месте. Когдафиксируют 1 ( влажн. вес,/об.) клеточный материал гранул, наблюдают 30-кратное увеличение числа жизнеспособных клеток, причем рост клеток происходит с временем удвоения б ч до окоьчания опыта, обусловленного сильным ослаблением струк- I туры альгинатного геля. Когда клетки

используют таким образом, при частом восстановлении активности посредством обеспечения условий для роста клеток, внутренняя стабильность ферментативной системы меньшая, чем в том случае, когда не происходит рост клеток. Таким образом, фермент является намного стабильнее, когда клетка находится в псевдопокое или в состояНИИ сохранения, чем когда ей дают возможность делиться.

Пример 2. Используют основную методику примера 1 с дополнительной стадией, в которой собранные клетки дробят шаровой мельницей в течение 90 мин при перед фиксированием. Исходная активность гранул такая же, как и при использовании целых клеток в примере 1, но полупериод жизни составляет примерно 170 дней.

Пример Зо Способ осуществляют по примеру 1, используя другие штаммы изомальтулозуобразующих микроорганизмов, в частности Erwinia rhapontici (N СРРВ 1578, 139 и 1739 и АТСС 2928А), Erwinia caratovora var atroseptica N СРРВ 139, Erwinia dissolvens (N CPPB 1862 и 2209), Prota.minobacter rubrum (CBS 57, 77) Servatia masscescens (N CIB 8285)и

13И) 11056

Serratia plymuthica (АТСС 15928). Измеряют специфичность, активность и стабильность зафиксированных штаммов. Затем, принимая во внимание патогенность микроорганизмов и тенден- j цию продуцировать полимер или пигмент , исследуемые штаммы оценивают на пригодность их использования в способе по примеру 1.

В табл. 2 приведена пригодность Ю штаммов для получения изомальтулозы. Таблица 2

I

При год-:

Штамм ность

E.rhaponticI NCPPB 1578

F..rhapontlc NCPPB 139 E.rhapontlci NCPPB 1739

E.rhapontlci ATCC 2928 +-Ы-+

E.carotovora var atroseptlca NCPPB 139

E.dissolvens NCPPB 1862 E.dissolvens NCPPB 2209 Serratia plymuthica

15928

ATCC

Serratia marscescens

NCIB8285 +

Protaminobacter rubrum CBS.57.77 +

Пример . Осуществляют способ по примеру 1, используя концентрацию сахарозы от 12,5 до 60( вес./ /об.). Активности и полупериоды жизни были измерены при исходном проценте превращения, равном %.

В табл. 3 приведено влияние концентрации сахарозы на образований изомальтулозы.

Таблица 3

- И

Продолжение табл. 3

0 Изменение концентрации сахарозы влияет на производительность фиксирующих колонок. Концентрация сахарозы влияет на активность зафиксированных клеток, причем концентрации

5 свыше примерно 0 ( вес./об. оказывает ингибируклцее действие. Стабильность (т.е. полупериод жизни) зафиксированных клеток существенно возрастает при увеличении концентрации сахарозы выше тех значений концентрации, которые использовали в предыдущих работах. Увеличение стабильности зафиксированных клеток при увеличении концентрации сахарозы перевешивает уменьшение активности, поэтому продуктивность колонки возрастает с увеличением концентрации сахарозы.

На равновесное отношение продуктов к сахарозе сильно влияет концентрация сахарозы в субстрате, причем наибольшее равновесное значение было получено при использовании (вес./об.) сахарозы. Таким образом, при использовании сахарозы равновесное отношение продуктов к сахарозе составляет 13,2:1, что соotBeTCTByeT 93% превращения в продукты.

Пример 5. Способ осуществляют по примеру 1, используя клетки Erwinla rhapontic N СРРВ 1578, зафиксированные другими способами иммобилизации.

В табл. показано влияние способа фиксирования активности изомальтулозуобразующих микроорганизмов на активность и полупериод жизни. 15101 Таблица k Альгинат кальция 0,325 8500 ЕАЕ-целлюлоза 0,583 «00 Полиакриламид 0,13 570 Клетки, агрегированные глутаровым альдегидом 0,153 О Каппа-каррагенан/смола лжеакации 0,2бЗ 37,5 Костный уголь 0,01 25 Агар 0,3 27 Ксантан/смола лжеакации 0,10 8 Пример 6. М-метил-М -нитро-N-нитрозогуанидин (, 100 мг/мл ) растворяют в 25 мл 0,10 М цитратного буфера при рН 6,0 при инкубировании в водяной бане при 37°С в течение 20 мин. Этот раствор затем добавляют к 50 мл профильтрованного питательного бульона, содержащего примерно 1 г свежесобранных клеток Е. rhapontici N СРРВ 1578. Затем клетки инкубируют

0,441

52,4 0,389 54,4 0,354 56,6 10 S 15 20 25 JQ

Таблица 5

59,52 52,53 47,77 616 30 мин при в водяной бане, потом их собирают и суспендируют в k% сахарозной среде табл. 1) в.течение ночи при С. Аликвоты (0,1 мл) помещают на 1,5% (вес.об.) агаровые чашки, содержащие сахарозу k% (вес./ /об.) , триптон 0,41 ( вес./об. и пептбн 1% ( вес./об., значение рН кото- , рых было доведено до 7,0, инкубирование проводят ч при . Отдельные колонии затем пересаживают в колбы для встряхивания и проводят культивирование в течение 48 ч при при встряхивании при 120 об/мин, затем клетки собирают, подвергают Ticпытанию и анализу. Мутантные штаммы менее специфичны, чем первоначальные клетки, несмотря на то, что они продуцируют изомальтулозу. Пример 7. Способ осуществляют по примеру 1, используя аль- , гинатный гель, содержащий зафиксированные клетки СРРВ 1578, который либо превращают в гель в блоке и нарезают на фрагменты, либо превращают в гель в виде непрерывного шнура и используют в намотанном на стержень виде или в виде нарезаных сегментов. При использовании в колонке эти зафиксированные клетки не проявляют заметного различия в активности или стабильности по сравнению с клетками, зафиксированными в сферических гранулах. Пример 8. Пример 3 показыает,-что наиболее пригодными являтся штаммы Е.rhapontici. Последуюее сравнение проводят в стандартизированных условиях, используя каждый из трех штаммов Е.rhapontici, зафикированных в альгинате кальция. В табл. 5 приведена продуктивность разных штаммов Е.rhapontici. 17 Пример 9. Ферментативную систему, ответственную за превращение сахарозы в изомальтулозу, экстрагируют растворителем из клеток Erwlnia rhapontici N СРРВ 1578, используя четыре разлиных способа, в частности встряхивание по Микле (Mickle), осмотический шок, ультразвуковую обработку или обработку де тергентом. Для встряхивания по Микле 2 г навески свежесобранных клеток встря хивают с 2 г сухого песка и с 2 мл дистиллированной воды 20 мин при комнатной температуре, используя ус тановку для встряхивания Микле. Для способа осмотического шока г навески клеток суспендируют в 10 мл деионизованной воды 30 мин при . Для ультразвуковой обработки 2 г навески клеток суспендируют в 15 мл деионизованной воды и обрабатывают

0,63 0,567 0,094

0,70 0, 0,038

0,63 05Т 0, 0,16 - 0, Из результатов, приведенных в табл. 6, Видно, что при встряхивании по Микле в поверхностный слой попадает примерно 5% активности клеток, а остальная активность связана с клеточными осколками„ Растворимый фе ментный экстракт, т.е. поверхностный слой, обладает активностью 0,09 г продукта/мл/ч, удельной активностью 0,0027,г продуктов/мг белка/ч и показывают двенадцёть различных белковых полос при анализе с помощью полиакриламидного гелевого электрофореза о Ферментативную систему можно более эффективно экстрагировать с по0,,60,0029

0,2533,00,08i«4

0,00561,990,0028

0,92 618 ультразвуком 30 мин, используя генератор диаметром насадки 2,5 см. Для обработки детергентом исполь-, зуют 10 мл водного раствора Тритона Х-10П (0,15% o6./o6.J , чтобы обработать 0,5 г клеток. После каждой соответствующей обработки полученные суспензии подвергают центрифугированию при 17000 в течение 30 мин при Клетки или клеточные осколки и поверхностный слой жидкости затем по отдельности фиксируют на гранулах альгината кальция, используя общий метод примера 1. Затем гранулы подвергают испытанию по отношению к 55% (вес./об.) сахарозе для определения активности синтеза изомальтулозы. В табл. 6 Приведена активность изомальтулозуобразующих микроорганизмов при разных способах разрушения клеток. Таблица 6 мощью осмотического шока клеток. С помощью этого способа экстрагируют примерно 9% клеточной активности, причем экстракт имеет активность 0,253 г продуктов/мл/ч и удельную активность 0, г продукта/мг белка/ч. Более того, электрофорез в пОлиакриламидном геле показывает только десять белковых полос. Сравнительно высокая чистота такого ферментативного экстракта вероятно обусловлена тем, что клетки не разрываются под действием осмотического шока. Ферментативная система связана с мембраной и/или заключена в клет1910ке, причем более вероятным местом расположения является периплазмическое пространство, особенно в силу того, что осмотический шок является самым лучшим способом экстракции, а также потому, что такие связа ные с периплазмическим пространством ферменты, как кислая фосфотаза, также были экстрагированы при обработке осмотическим шоком. Из данных табл. 6 следует, что дробленые клетки обладают наибольшей активностью. Это, вероятно, вызвано устранением препятствия для диффузионного переноса субстрата, создаваемого стенками и мембраной не поврежденной клетки. Однако нет существенного различия активностей клеток, подвергнутых осмотическому шоку, нежизнеспособных клеток и свежих жизнеспособных клеток, что наглядно показывает что здесь не действует активная транспортная система для притока сахарозы внутрь клетки, поскольку такая система была бы зависима о,т интегрального метаболизма целой клетки и она могла бы быть, по-видимому, утрачена при осмотическом шоке клеток. ; Дальнейшее исследование свободного от клеток ферментного экстракта, полученного осмотическим шоком, показало, что он имеет оптимальное зна чение рН,.равное 7,0, оптимальную тёмпературу и обладает макси,1альной активностью для 35% Свес./об раствора сахарозы. TOT фактJ что оптимальная концентрация субстрата для растворимой ферментативной сис6 ° . темы ниже, чем. для свободных клеток 55) или для зафиксированных -клеток, по-ёидимому, отражает изменение внутренних свойств ферментативной системы, зависящей от локализации. Когда ферментативную систему, экстрагированную- встряхиванием по Микле, используют на ( вес./об. сахарозе, зафиксированный фермент обладает исходной активностью 0,0067 г продукта/г гранул/ч и имеет полу11ериод жизни 620 ч, обеспечивая первоначальную степень превращения 81,5%. Таким образом, использование предлагаемого изобретения позволяет резко увеличить стабильность и продуктивность изомальтулозуобразующей сист-емы, как 3d счет ее иммобилизации в геле, так и благодаря использованию новых штаммов микроорганизмов рода Erwinia, применению более концентрированных растворов сахарозы и более полному превращению сахарозы в целевой продукт. Так, иммобилизация в геле альгината кальция позволяет увеличить время полужизни клеток от нескольких до 8500 ч, а использование 5 и 55%-х растворов сахарозы приводит к 1,510-кратному увеличению стабильности клеток по сравнению с опытами, в которых применяют 35%-ые растворы, без существенного изменения активности системы. Кроме того, изобретение позволяет использовать изомальтулозуобразующую систему микроорганизмов без культивирования и размножения самих микроорганизмов.

fS

ej

I aj

аг

tff 4O s6 it т

vWtfPMMV Л$4М|ЛАМ19 . tfWIlJiAMi

AK

S

« I

It /

ll

i

§ t 15

4ff ffff dO т

/7/у уу АЛГ7 / /ff ffaffjv&

0fff.