Способ получения фруктозилдисахаридов Советский патент 1991 года по МПК C12P19/12 C12P19/18 C12P19/18 C12R1/125 

Изобретение относится к микробиологическому синтезу веществ, касается способа получения фруктозилдиса- харидов, пригодных в качестве сахаристых веществ в пищевой промышленности, специфически известных как TGF (получаемые фруктозилдисахариды iпредставляют собой промежуточный продукт для использования при получении сукралозы, ранее известной как TGS),

Цель изобретения - повышение качества целевого продукта.

Изобретение предусматривает получение фруктозилдисахаридов общей формулы проведением реакции альдозы общей формулы

см

А

-0

ОН-/У,он

(D

НО ОН

где А - водород или группа CHgX;

X ,.водород, алифатическая или 10 «, ароматическая карбоксигруппа или алкоксигруппа или арил- алкоксигруппа,

с сахарозой или рафинозой в присутствии фруктозилтрансферазы, продуцируе- 15 мой Bacillus subtilis NCIB № 11871, 11872 или 11873, характеризующейся Km для сахарозы по крайней мере 0,1 М в отсутствие акцептора альдозы, не образующей значительных количеств 20 осаждаемого спиртом полисахарида-, левана из донора фруктозы в отсутствие акцептора альдозы, и стабильной к действию поверхностно-активных веществ, имеющей оптимальную актив- 25 ность при , активной не менее 20 мин при 45°С. Используемый фермент не проявляет инвертазной активности, что благоприятно влияет на качественные характеристики целевого 30 продукта. Km для фруктозилтрансферазы, полученной из В.subtilis NCIB 11871, составляет 0,2 М для сахарозы в отсутствие акцептора, в отличие от известного, Km которого равна 35 0,02 М.

Используемая фруктозилтрансфера- за не ускоряет реакцию диспропорцио- нирования, т.е. не превращает оли- госахариды с малой молекулярной мае- 40 сой в леван с высокой молекулярной массой.

Источником фруктозы для реакции может быть любой олиго- или дисаха- рид,. содержащий, предпочтительно, 45 незамещенное й-фруктозильное кольцо, присоединенное к аномерному углероду альдозы связью (), как

в сахарозе (В-В-фруктозил-оН)-глюко- пиранозид) , рафинозе ((-0-галак- 50 топиранозил- (I - -ь- 6) -O-of-D-глюкопи- ранозил(1 - -,2)-|Ъ-В-фруктофурано- зид) или с.тахиозе. „ -Реакцию между донором и акцептором фруктозы проводят при рН 5,4- 6,0 и 30°С, оптимальных значениях для действия фермента, который, предпочтительно, используют иммобилизованным на нерастворимой подложке.

Продуцируемые фруктозилтрансфера- зой штаммы В.subtilis по классическим тестам отвечают требованиям идентификации видов. В.subtilis NCIB 11871 является лактозоотрицательным, показывающим различное продуцирование кислоты и ксилозы. В.subtilis NCIB

11872также является лактозоотрицательным и дает отрицательные резуль - таты с D-маннозой, мелибиозой и трега- лозой в реакции ONPG. В.subtilis NCIB

11873является лактозоположительным и дает отрицательные результаты с D-маннозой и инулином

Пример 1. Получение 6-ацета- та сахарозы,

а) Получение фермента. |Ъ-Фруктозил- трансферазу получают при культивировании Bacillus subtilis, штамм NCIB 11871. Фермент индуцируют сахарозой в процессе роста клеток во встряхиваемых колбах (емкость 250 мл, 4 колбы), содержащих минимальную сахарозную среду (100 мл на колбу). Культуру инкубируют до последней экспонентной фазы микроорганизмов, встряхивания при , затем содержимое четырех колб объединяют и культуральную среду отделяют от клеток путем центрифугирования (5000 g в течение 15 мин), 20-30% общего количества фермента остается в ассоциации с клетками. Полученную надосадочную жидкость доводят до 65% насыщения путем до- бавления твердого сульфата аммония и оставляют стоять в течение 45 мин при . В результате этого в осадок выпадает основное количество нежелательной инвертазы и других белковых составляющих, а большая часть фермента остается в растворе. Затем образец повторно центрифугируют (20000 g в течение 30 мин) и выгружают осадок, содержащий инвертаэу. Добавляют еще сульфат аммония в раствор для доведения его до 95% насыщения и оставляют стоять еще на 45 мин при 0°С, Образуется второй осадок, в основном фруктозилтрансфераза, которую собирают центрифугированием (40000 g в течение 45 мин) и повторно растворяют в 12 мл 50 мМ осфатного буфера, рН 6,0. Результатом двух осаждений и растворения торого осадка является очистка и концентрация фермента, такая, что с омощью электрофореза с полиакрил- амидным гелем обнаружена только ода полоса белка. Оставшийся сульат аммония удаляют из системы полуения фермента путем диализа (0°С в ечение 4 ч) в присутствии 50 мМ фосатного буфера.

Подвергнутый диализу фермент ис-- следуют перед и после добавления n-оксиртутьбензоата, который подавляет инвертазу, но не оказывает действия на фруктозилтрансферазу. Обычно этим способом определяют, что препараты фруктозилтрансферазы свободны от инвертазы. Содержание протеинов в препаратах оценивают примерно 0,45 мг/мл путем определения абсорб- ции белков при длине волны 280 нм. Черный пигмент часто присутствует даже в очищенных ферментных препаратах, Но он не оказывает влияния на их активность.

б) Получение 6-ацетата сахарозы 6-Ацетат глюкозы (80 г высушивают в вакууме до постоянного веса) и гранулированную сахарозу (160 г) растворяют при комнатной температуре в 100 мл буферного раствора Макилвайна при рН 5,4 и разводят до 600 мл (т.е. 40 мас.% деионизов анной водой. Этот раствор затем профильтровывают и добавляют 28 мл раствора фермента. Реакционную смесь инкубируют при 30ЙС. отбирают через определенные временные интервалы образцы до тех пор, пока по данным ЖХВД не устанавливают, что 6-ацетат сахарозы больше не образуется и достигнута максимальная концентрация 6-ацетата сахарозы 120 г/л. Фермент удаляют фильтрованием реакционной смеси через колонку с ДЭАЭ целлюлозой, которая адсорбирует фермент. Другим способом его можно было денатурировать путем нагревания при 65°С в течение 1 ч. Удаление фермента важно, так как он может способствовать медленному гидролизу 6-ацетата сахарозы и высвобожать фруктозу.

Затем продукт выделяют с помощью препаративной ЖХВД и получают 6-ацетат сахарозы по меньшей мере 65% истоты при общем выходе 50%. Начальная скорость реакции ферментации составляет 244,5 мг 6-ацетата сахарозы на 1 мг фермента в час. Выход на стадии ферментации составил 58% в расчете на расход 6-ацетата глюкозы или 48% в расчете на образовавшийся 6-ацетат сахарозы.

Пример 2. Получение 6-де- оксисахарозы.

Выделение, очистка и кристаллизация. 6-Деокси-О-глюкозу (D-хиново- зу, 20 г) и сахарозу подвергают реакции, аналогичной реакции, описанной в примере 1, и получают смесь 6-де- оксисахарозы, D-хиновозы, сахарозы

и глюкозы, общий объем 140 мл. 6-Де- оксисахарозу отделяют от смеси с помощью препаративной ЖХВД, используя колонку с обратной фазой waters prepak 500-C1.8 и воду в качестве

5 элгаента. Наблюдается удивитель но большое различие во времени удер- жания 6-деоксисахарозы и времени «удержания других компонентов смеси. D-хиновоза, сахароза и D-глюкоза

0 элюированы через 4-9 мин после введения, а 6-деоксисахароза только через 29 мин (высота максимального пика) ,-Длительное время выделения позволяет выделить большое количество

5 вещества за инъекцию, чем было бы возможно в другом случае. Элюат, содержащий 6-деоксисахарозу, выпаривают досуха при пониженном давлении (температура бани ) и получают

0 прозрачный сироп (16,7 г, 42%), который кристаллизуется при комнатной температуре..Продукт рекристалли- зуют из этанола и он имел т,пл, 180- 181°C,X;L +57,6° (с 2,5, вода).

5 Масс-спектр, т/е: 293 (М -СНуК)) . С-ЯМР-спектр (DgO раствор, относительно молекулярного ДСС при Ом.д.: Атом углерода Химический сдвиг

м.д.

0 ,32

1 94,70

3 3 5

5 4f 3 2 4

6f Р 6

0

84,01 79,04 77,74 76,73 74,93 73,95 71,09 65,02 63,77 19,36

Пример 3. Повторяют процедуру, описанную в примере 1, но вместо 6-ацетата на стадии б используют б-бензоат г люкозы. Получают анало- гичный результат.

1 Пример 4. Способ, описанный в примере 1, модифицируют, используя фермент, полученный при культивировании штамма Марбург 168, штамм NCIB 11872 или 11873 на стадии б. Реакция проходит таким же образок, но с меньшей скоростью.

Пример 5. Иммобилизация и очистка фруктозилтрансферазы штамма NCIR 11871 с использованием ионообменной ДЭАЭ целлюлозы и получение ксил- сахарозы.1

Ионообменную ДЭДЭ целлюлозу (DE52) интенсивно промывают 50 мМ буфером Макилвайна рН 5,4 и затем забуферен- ным субстратом (сахароза-ксилоза 2:1, 40 мас,%, общие сахара). После фильт-4 рования почти досуха через воронку Бюхнера ДЭАЭ целлюлозу (10 г) смешивают с 8 мл препарата фруктозилтрансферазы, полученной при культивировании B.subtilis, как в приме- , 2 ре 1, в течение 15 мин при 306С при перемешивании. Полученную смесь ДЭАЭ (Целлюлозы и фермента загружают в 110-миллшштровую колонку с водяной рубашкой (19x1 см и поддерживают при 2 30°С с помощью термоциркулятора Черчилла. ДЭАЭ целлюлозе дают стечь под действием собственной тяжести и эти стоки собирают. Субстрат закачивают вверх по колонке со скоростью 3 1,0 мл/ч, используя насос Ватсона- Марлоу, элюат-собирают через определенные промежутки времени и исследуют на активность фруктозилтрансферазы. Также определяют поглощение 3 на длине золны 280 нм (F ngp)« Для исследования 0,1 мл жидкого образца или О,1 г иммобилизованного фермента (на DE 52) инкубируют с 2 мл субстрата при 30 С в течение 4 ч.

Используя субстрат ксилоза-саха - роза для приготовления ксилсахарозы, концентрацию и активность истощенного раствора, оставшегося после за- 45 вершения процедуры иммобилизации, сравнивают с концентрацией и активностью первоначального ферментного препарата. Обнаружено, что 68,5% первоначально присутствовавшего фермента tg в клеточном экстракте было иммобилизовано вместе с 83% первоначапьно присутствовавшего белка. Иммобилизо-- ванный фермент имеет первоначальную активность 80,2% от активности экви- - валентного количества свободного ферт мента; активность обоих препаратов соответственно равна 0,38 г ксилсахарозы / г иммобилизованного фермен0

с п 5 0 5

0

5 tg -

та в час и 0,865 г ксилсахарозы/ мл экстракта фермента з час.

Иммобилизованный фермент (10 г) непрерывно подают в колонку при 30°С в течение 2 нед при постоянном рН элюата, микробиологическое заражение исключено. В течение первых трех дней небольшие количества белка и фермента десорбировались (примерно 24% первоначально адсорбированного белка и 2,3% первоначально адсорбированного фермента). Активность иммобилизованного фермента падает с временем полураспада 95 ч, и имеется обратная зависимость между степенью конверсии субстратов в продукты и скоростью течения по колонке. При самой малой скорости потока, 0,086 объемах колонки без насадки (экв. ) и 80% конверсии в ксшт- сахарозу получают элюат, содержащий 2) г/л ксилсахарозы. Этот выход выше, чем выходы, полученные в периодических реакциях, вероятно потому, что кинетика течения со структурным ядром колонки способствует образованию ксилсахарозы, так как продукты непрерывно выгружают из колонки и, таким образом, они не аккумулируются и не вызывают замедление реакции, В целом в процессе этих операций 20-25 г ксилсахарозы образуются в состоянии, из которого легко получить чистую ксилсахарозу.

В противоположность первоначально использованному растворимому ферменту иммобилизованный фермент вызвал образование в процессе реакции побочных продуктов. Образовалось незначительное количество фруктозы - меньше, чем образуется с помощью первоначального экстракта фермента, использованного для иммобилизации, вероятно потому, что инвертаза, которая загрязняет экстракт, только частично адсорбирована DE 52. В элюате после иммобилизованного фермента были обнаружены некоторые второстепенные соединения, которые были элюирова- ны на последней стадии КХЕДсо временем удерживания 13 и 20 мин, хотя их не обнаруживали при анализе продуктов реакций с растворимыми фермента- ми. Вероятно это олигосахариды, об- разевавшиеся из обычных реагентов с помощью фермента. Предположительно, что удерживание молекул реагента иммобилизованным ферментом увеличивает

время их контакта с ферментом таким образом, что существует возможность полимеризации.

Так как содержание ксилозы в субстрате составляет 133 г/л, то максимально возможная концентрация ксил- сахарозы составляет 266 г/л. Максиальная концентрация при 0,086 экв./ч- составляет 80% от этой величины, т.е. JQ 210 г/л, а расчетные данные на основании расхода ксилазы во время реакции составляют 69,5%. Выход выше, чем в периодических реакциях, так как природа процесса течение со струк- 15 турным ядром такова, что она обусловливает постоянный отток продукта, и так как продукт относительно неполярный по сравнению с субстратом и поэтому избирательно отводится от поло- 20 жительно заряженной иммобилизирующей подложки, то оба эти эффекта способствуют образованию ксилсахарозы.

Этот же способ используют для поучения 6-ацетата сахарозы из 6-аце- 25 тата глюкозы, 6-0-метилсахарозы из 6-0-метилглюкозы и 6-0-бензилсахаро- зы из 6-0-бензилглюкозы.

Фермент, полученный по способу, описанному в примере 1, (0,1 мл) сме- -jQ ивают с 2 мл 40%-ного (мае./об.) f раствора сахарозы и ксилозы (1:1), забуференного при рН 5,5 при 30°С. аличие ксилсахарозы определяют с по- мощью ЖХВД. Образование левана опре- ,5 деляют визуально. Ниже приведены результаты сравнения действия различных ферментов,

Эти ферменты по изобретению преобразуют по меньшей мере в 10 раз до больше ксилсахарозы чем фермент, полученный с помощью штамма Марбур- га, и по меньшей мере в 100 раз больше в случае использования фермента, полученного с помощью штамма NCIB J1871. Причем значительно меньше идет конкурирующее образование левана.

Использование рафинозы в качестве донора.

Пример 6. Образование ксилсахарозы.

РафиНозу и сахарозу растворяют в буфере Макилвайна (рН 5,4) и инкубируют с фруктезилтрансферазой из примера 1 при 30°С до момента, когда анализ ph/c показал, что больше не образуются ксилсахароза и мелибиоза (примерно 100 ч .Затем фермент де50

55

натурируют путем нагревания ( или в альтернативе его можно удалять путем адсорбции в ДЭАЭ целлюлозу). Измеряют как количества ксилозы и рафинозы при общей концентрации сахара 30 мас.%, так и абсолютную концентрацию Сахаров, при отношении рафино- за: ксилоза 2:1 (мае./мае.). Наибольшие концентрации ксилсахарозы, полученные tв ходе этих экспериментов, составляют 9,5 г/100 мл при концентрации субстрата 65 г/100 мл. Затем ксилсахароэу изолируют посредством препаратного hp/c, представляющего собой последний пик, подлежащий элюи рованию, с временем выдерживания 15,5 мин (ксилоза около 3 мин, рафи- ноза и мелибиоза примерно по 7 минут каждая).

Пример 7. Образование 6-де- оксисукрозы.

Осуществляют реакцию рафинозы и 6-деоксиглюкозы, как было описано, используя отношение рафиноза: 6-де- оксиглюкоза 2:1 и общую концентрацию сахара 30%. По истечении времени инкубации примерно 40 ч получают 4 г 6-деоксисахарозы на 100 мл субстрата.

Результаты исследований по примерам 1-7 приведены в таблице,

Формула изобретения

1. Способ получения фруктозилди- сахаридов общей формулы , .-

АСНоОН

НОЧ ( СН2ОН

но он но он

- (I)

где А - водород или группа СН@Х, X - водород, алифатическая или

ароматическая карбоксигруппа, или алкоксигруппа, или арил- алкоксигруппа

путем проведения реакции альдозы общей формулы

А

V-О

. он-/

но он 1Д) I

1116

где А имеет указанное значение, определенное для формулы (II), с сахарозой или рафинозой в присутствии фермента гликозилтрансферирующего дей ствия, продуцируемого Bacillus subti- lis при оптимальных условиях действия фермента, отличающийся тем, что, с целью повышения качества целевого продукта, в качеств е фермен- та гликозилтрансферирующего действия используют фруктозилтрансфераэу, продуцируемую Bacillus subtilis NCIB № 11871, 11872 или 1 1873, имеющую Km для сахарозы по меньшей мере О,1 М в отсутствие акцептора альдозы, не образующей значительных количеств осаждаемого спиртом левана из донора фруктозы в отсутствие акцептора альдозы, и стабильную к действию по- верхностно-активных веществ, имеющую оптимальную активность при температуре 30°С, активную не менее 20 и мин при температуре до 45°С,

712

2, Способ по п. 1 , о т л и ч a tout и и с я тем, что используют иммобилизованный фермент.

Ксилсахароза, г/мл фермента в час

Образованиелевана

8,6 О

2,9 Заметно

1,4 +

0,08 ++

0,19 ++

- 0,87 ++

Изобретение относится к микробиологическому синтезу веществ, касается способа получения фруктозилдиса- харидов, пригодных в качестве сахаристых веществ в пищевой промышленности, специфически известных как TGF. Получаемые фруктозилдисахариды представляют собой промежуточный продукт для использования при получении сукралозы (ранее известной как TGS). Цель изобретения - повышение качества целевого продукта. Способ предусматривает проведение реакции альдозы с сахарозой или рафинозой в присутствии фруктозилтрансферазы, продуцируемой Bacillus subtilis NCIB № 11871, 11872 или 11873, имеющей Km для дахарозы по меньшей мере 0,1 М в отсутствие акцептора альдозы, которая не образует значительных количеств левана, осаждаемого спиртом из донора фруктозы в отсутствие акцептора альдозы, стабильной к действию поверхностно-активных веществ, которая обладает оптимальной активностью при 30°С, к активной в течение по меньшей мере 20 мин при температуре до 45°С. Предлагаемый фермент не проявляет инвертазной активности что благоприятно влияет на качественные- характеристики целевого продукта, а также не ускоряет реакцию диспропорционирования, т.е0 не превращает олигосахариды с малой молекулярной массой в леван с высокой молекулярной массой, 1 з.п. ф-лы, -1 табл. из OS со о С5