Способ получения изомальтулозы Советский патент 1989 года по МПК C12P19/12 C12P19/12 C12R1/425 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии и касается непрерывного преобразования сахарозы в изомальтулозу (палатинозу, б70-об-В-глюкопиранозид- D-фруктозу) при помощи неподвижных клеток бактерий.

Изональтулоза является промежуточным продуктом для получения глюкопи- ранозид-1,6-манита и глюкопиранозид- 1,6-сорбита (изомальтита), которые являются заменителями сахара.

Цель изобретения - повышение выхода и чистоты целевого продукта.

Для реализации способа с целью получения иммобилизованных клеток осу ществляют оптимальное размножение клеток в питательной среде, содержащей только 5 мас. сухих веществ.

Питательная среда содержит густой сироп (промежуточный продукт сахарной промышленности, маисовую воду для набухания и (, Однако предпочтительным является использование более дешевого питательного субстрата, который состоит только из мелассы кормовой свеклы и (Ш4)

Для приготовления такого питательного раствора мелассу разбавляют дистиллированной водой до 5%-ного содержания сухого вещества. В качестве дополнительного источника азота и фосфата на 100 кг такого раствора до- бавляют 0,1 кг (№4)4 ПРО. Значение рН устанавливают равным 7,2 при помощи натрового щелока, раствора едкого калия или соляной кислоты.

СМ

Вакцинация микроорганизма, например Protaminobacter rubrum CBS 57.77 образующего изомальтулозу, происходит при промывке 10 мл стерильного пита- тельного раствора указанного состава а ферментацию осуществляют в качалоч- ных колбах, заполненных 200 мл этой питательной среды, при 29°С. Когда количество микроорганизмов в загру- женной культуре достигает 5x10 ми кроорганизмов/мл, культуру переносят в небольшой ферментер с питательной средой указанного состаба и далее культивируют при возможно более высокой степени аэрирования и скорости перемешивания при 29 С, Контроль за размножением осуществляют так же, как и контроль за размножением в ка- чалочных колбах, путем определения числа микроорганизмов. Как только количество микроорганизмов достигнет значения 5x10 микроорг анизмов/мл, ферментер освобождают.

Для получения иммобилизованных клеток в основном пригодны все методы иммо.билизации клеток I.CUIBATA (Immobilized Enzymes, John Wiley and sons, New Jork, London, 1978),

В качестве предпочтительных при- знаны следующие методы.

a)Содержимое для ферментации добавляют либо в сам ферментер, либо

в другой сосуд с 1%-ным раствором катионоактивного коагулянта. Требуемое количество коагулянта должно быт определено в предварительном опыте. Клеточную массу, подвергнутую коагуляции, отстаивают, освобождают от лишней воды и далее осадок дважды промывают фосфатным буфером 0,1 Н, рН 7.0. После этого клеточную мйссу обезвоживают до получения пастообразного вида, прессуют в полости, сушат размалывают и просеивают.

b)К 10 л ферментативного бульона при медленном помешивании добавляют О,5-2,л О,2 -ного раствора хитозана, .(коагулированную клеточную массу промывают фосфатным буфером- О,1 М,

рН 7,0, обезвоживают в центрифуге. например с химическим принципом действия или в отстойной, прессуют в полосы, сушат, размалывают и просеи- . вают.

c)В центрифуге клеточную массу отделяют от ферментационного бульона 5-20 г этой клеточной суспензии (содержание сухого вещества 10%) суспен

0

5

о

0

0

дируют в 45-60 мл раствора альгината (8 г в 100 мл) и при помощи шприца (диаметр иглы 0,55 мм) каплями вводят в раствор СаС. Появляющиеся гранулы примерно 15 мин перемешивают в растворе СаС и после этого промывают водой. Приблизительно в течение 20 ч гранулы сушат при комнатной температуре.

d)В центрифуге клеточную массу отделяют от ферментационного бульона, промывают фосфатным буфером (0,1 М, рН 7,0) и подвергают сублимационной сушке..

При 90 С под флегмой 15 г ацетата целлюлозы растворяют в 100 мл смеси диметилсульфоксида и ацетона (б: ). После охлаждения до 30 С добавляют 3-30 г сублимированных клеток. Эта суспензию при помощи инъекционного шприца (игла 0,8 мм) в виде капель вводят в воду. Образующиеся гранулы высушивают,

e)В центрифуге клеточную массу отделяют от ферментационного бульона. 5 г такой клеточной массы суспендируют в .5 мл физиологического раствора поваренной соли при 5-50°С. 1,7 г К-каррагинана (растворимый полисаха- ридный эфир серной кислоты) растворяют в 3 мл физиологического раствора поваренной соли при 45-60 С. Оба раствора смешивают и в течение 30 мин эту .смесь выдерживают при 10 С. Появляющийся гель фиксируют в холодном 0,3 М растворе КС1 и потом раскалывают на куски величиной примерно 3 мм.

f)ферментационный бульон смешива- .ют сначала с 1%-ным раствором катионоактивного коагулянта, а потом с ным раствором анионоактивного коагулянта либо в самом ферментере, либо

в другом сосуде. Требуемое количество коагулянтов должно быть определено в предварительном опыте. Скоагулиро- ванную клеточную массу отстаивают, промывают фосфатным буфером 0,1 М, рН 7,0, прессуют в полоски, сушату размалывают и просеивают.

Клетки микроорганизмов, полученные по описанным методам, подвергают иммобилизации сшивкой. Лля сшивки применяют бифункциональные препараты, например глутаровый альдегид. Обычная концентрация глутарового альдегида , 2,5-5,0 при длительности контакта мин в случае использования микроорганизмов, образующих изомальтулозу, может не соблюдаться. Было обнаружено, что все неполвиж- ные препараты при этих условиях полностью иммобилизованы, В качестве оптимальных условий для образования поперечных связей согласно предлагаемому способу концентрацию глутарового альдегида принимают равной 0,1 при длительности обработки 10 мин.

Неподвижные клетки с поперечными связями, полученные по указанным способам, подают в колонну реактора. В этом реакторе поддерживают равномерную температуру, а отношение диаметра и высоты составляет 1:1 - 1:20, преимущественно 1:1 - 1:10, предпочтительно 1:1,5-1:5. Чистый раствор сахарозы (концентрация 5-75%) при 40-65°С нагревают через колонну либо сверху вниз, либо снизу вверх. При этом скорость потока устанавливают такой, чтобы время контакта составило 1 - 10 ч, преимущественно ч (это соответствует 0,2-0,8 г ,сахарозы, преимущественно 0,4-0,6 г, на 1 г неподвижных (сухих) клеток в 1 ч). При этом преобразуется полностью вся введенная сахароза, причем получают

10

клетки промывают 10 мл питательного стерильного субстрата, состоящего и 8 кг сахарного сиропа, густого, кон центрации б5%, 2 кг маисовой воды для набухания, 0,1 кг (NH),. и кг дистиллированной воды (при необходимости значение рН устанавли вают равным 7,2). Эта суспензия слу жит в качестве затравочного веществ для предкультуры в колбе объемом 1, с 200 мл питательного раствора указанного состава, находящейся во встряхивающем механизме.

После 30-часового инкубирования при 59°С 16 л питательного раствора указанного состава,разливают по 20 колбам (4 л), рассеивают в небольшом 30-литровом ферментере и ферментирую 20 при 29°С при аэрации 20 л в 1 мин и скорости перемешивания 350 об/мин. Увеличивающееся количество клеток определяют микроскопическим методом После того, как число клеток достигнет 5x10 клеток/мл j содержимое ферментера переводят в другой сосуд, в котором его смешивают с катионоак- тивным коагулянтом (например, PRIMAFLOC C7V фирмы Rohtn Haas,

)5

25

глюкозы, 4% фруктозы, В2% изомаль- ,„ Филадельфия, США). Скоагулированные

,л п Of 4 Л . ТЧJ L/

тулозы и 13 l-O-oi-D-глюкопиранозид-. D-фруктозы.

Путем простого охлаждения раствора изомальтулозу частично кристаллизуют. При выпаривании и охлаждении из ма. точного раствора выкристаллизовывает- 5 ся дополнительное количество изомаль тулозы, таким образом, в целом из полученной изомальтуло зы может открисклетки отстаивают, округляют, промывают фосфатным буфером (0,1 М, рН 7,0) и обезвоживают на центрифуге. Далее массу экструдируют в полоски, сушат на воздухе и размалывают.

Просеянную фракцию 0,3-0,8 мм из полученного препарата в течение 10 мин перемешивают в 0, растворе глутарового альдегида, промываю фосфатным буфером (0,1 М, рН 7,0) и

Просеянную фракцию 0,3-0,8 мм из полученного препарата в течение 10 мин перемешивают в 0, растворе глутарового альдегида, промывают фосфатным буфером (0,1 М, рН 7,0) и

таллизовываться 91,5%i. . ... , В предпочтительном варианте испол- освобождают от надосадочной жидкости нения способа раствор сахарозы про- путем декантации. Определение фермен- пускают через колонну более быстро тативной активности иммобилизованных для того, чтобы преобразовалось толь- клеток дает удельную активность .ко 75-80 сахарозы. Часть изомальту- 1 60 ед/г сухого вещества. В термоста- лозы может быТь по лучена в кристалли- тируемую колонну вводят столько иммо- ческой форме путем охлаждения потока билизованных клеток, чтобы объем слоя продуктов, а остаток после добавления клеточной массы.составлял 1бО см.

Это количество соответствует 60. г сухого вещества. Колонну затем нагревасвежего раствора сахарозы еще раз пропускают через колонну. Преимущество -такого варианта проведения процесса состоит в том, что образование 1 -О.-с -В-глюкопиранозид-ГЬфруктозы подавляется благодаря более короткому. времени контактирования ив итоге может быть достигнут больший выход изомальтулозы.

Пример. От заражения штамма Erotaminobacter. rubrum CBS 57.77

10

124896

клетки промывают 10 мл питательного стерильного субстрата, состоящего из 8 кг сахарного сиропа, густого, концентрации б5%, 2 кг маисовой воды для набухания, 0,1 кг (NH),. и кг дистиллированной воды (при необходимости значение рН устанавливают равным 7,2). Эта суспензия служит в качестве затравочного вещества для предкультуры в колбе объемом 1, л- с 200 мл питательного раствора указанного состава, находящейся во встряхивающем механизме.

После 30-часового инкубирования при 59°С 16 л питательного раствора указанного состава,разливают по 20 колбам (4 л), рассеивают в небольшом 30-литровом ферментере и ферментируют 20 при 29°С при аэрации 20 л в 1 мин и скорости перемешивания 350 об/мин. Увеличивающееся количество клеток определяют микроскопическим методом. После того, как число клеток достигнет 5x10 клеток/мл j содержимое ферментера переводят в другой сосуд, в котором его смешивают с катионоак- тивным коагулянтом (например, PRIMAFLOC C7V фирмы Rohtn Haas,

)5

25

,„ Филадельфия, США). Скоагулированные

клетки отстаивают, округляют, промывают фосфатным буфером (0,1 М, рН 7,0) и обезвоживают на центрифуге. Далее массу экструдируют в полоски, сушат на воздухе и размалывают.

Просеянную фракцию 0,3-0,8 мм из полученного препарата в течение 10 мин перемешивают в 0, растворе глутарового альдегида, промывают фосфатным буфером (0,1 М, рН 7,0) и

. . ... , освобождают от надосадочной жидкости путем декантации. Определение фермен- тативной активности иммобилизованных клеток дает удельную активность 60 ед/г сухого вещества. В термоста- тируемую колонну вводят столько иммо- билизованных клеток, чтобы объем слоя клеточной массы.составлял 1бО см.

освобождают от надосадочной жидкости путем декантации. Определение фермен- тативной активности иммобилизованных клеток дает удельную активность 60 ед/г сухого вещества. В термоста- тируемую колонну вводят столько иммо- билизованных клеток, чтобы объем слоя клеточной массы.составлял 1бО см.

50

Это количество соответствует 60. г сухого вещества. Колонну затем нагревают до 50 С и через нее непрерывно пропускают раствор сахарозы со скоростью протекания 20 .. Выходящий и-з колояны поток продукта имеет следующий состав, г/10О г сухого ве- 55 щества:

Глюкоза1

Фруктоза 4

Сахароза. О

Изомальтулоза 82- 1-О-о -В-глюкопира- : ноизид-Б-фруктоза 13Полученный раствор изомальтулозы подают в кристаллизатор для охлаждения до 20 С и выкристаллизовавшуюся изо- мальтулозу отделяют от маточного раствора путем центрифугирования на решет10

15

20

атом барабане. Маточный раствор при 0°С выпаривают до содержания сухого ещества 80% и снова охлаждают до 0°С в кристаллизаторе для охлаждеия. Выкристаллизовавшуюся изомальту- озу отделяют от второго маточного, аствора (мелассы) на .центрифуге с ешетчатым барабаном. Благодаря этой вухстадийной кристаллизации получают 1,5% кристаллической имеющейся в астворе изомальтулозы.

В 100 кг выходящего из реактора ас.твора изомальтулозы содержится 0 кг воды и 70 кг сухого вещества, з которых S7, кг (82%) составляют зомальтулозу. На первой стадии крис- 25 аллизации отделяют 32, кг изомаль-. улозы 1 примерно 1 кг промывочной воды добавляют при центрифугировании. олучают 68,6 кг маточного раствора 37,6 кг сухого вещества и 31 кг во- зо ы. Чтобы этот мато -ный раствор концентрировать от содержания 5,8% сухого вещества до содержания 80% сухого вещества до второй стадии кристализации, нужно испарить 21,6 кг воды, причем количество снижается на 47,0 кг,; заканчивают.

На второй стадии кристаллизации получают 20,1 кг изомальтулозы, таким образом, общий выход составляет 52,5 кг или 91,5% находящейся в эфлю- ате из -реактора изомальтулозы (соответствует 75% используемой сахарозы), Изомальтулоза с первой стадии кристаллизации имеет чистоту более 99,5% и может непосредственно использоваться далее. Изомальтулоза с второй степени кристаллизации (20,1 кг) имеет чистоту более 96,0% и ее нужно пере- кристаллизовывать. Для этого ее сначала растворяют в- 13, кг воды и затем путем испарения и охлаждения выкристаллизовывают ,

Испаряющееся количество воды COCY тавляет 21,6+13 , кг для получения 52,5 кг изомальтулозы или 0,67 кг/кг изомальтулозы,

Пример2, а)0т заражения штамма Protaminobacter rubrum CBS .77 клетки промывают 10, мл ст-ерильнс5го пит тоящего из 6 сы концентра и 93)65 кг д необходимост вают равным суспензия сл ного веществ бе объемом 1 раствора ука щейся во вст После 30-час 29°С 1б л пи занного сост бам (1 л) , е вом ферменте ции при 29°С скорости пер

. Далее про примеру 1„

Приме штамма Prota 51,11 клетк ной смеси 1 б5% и 2 ч. в жащей 0,5 г/ зия служит в материала дл емкостью 1 л раствора ука зованного 20 щихся в вибр

40

культивирова

30 С предвар вора указанн по 20 колбам вают в ферме ментируют пр и при скорос /мин.

Выращенны тельного рас прививочного емкостью 300 раствора (см и водой с со ва 25%, чист хое вещество скоростью аэ при 30°С и с /мин.

После . ляют непреры

50

55 ления 0,2 ч

равное колич тельного рас рывно удаляю

я 10

15

20

25 зо ; заканчивают.

рильнс5го питательного раствора, состоящего из 6,25 кг свекольной мелассы концентрации 80%, 0,1 кг (NH) и 93)65 кг дистиллированной воды (при необходимости значение рН устанавливают равным 7,2 при помощи НС1). Эта суспензия служит в качестве затравочного вещества для предкультуры в колбе объемом 1 л с 200 мл питательного раствора указанного состава,находящейся во встряхивающем механизме. После 30-часового инкубирования при 29°С 1б л питательного раствора указанного состава, разлитого по 20 колбам (1 л) , его рассеивают в 30-литровом ферментере, и подвергают ферментации при 29°С при аэрации 20 л/мин и скорости перемешивания 350 об/мин.

. Далее процесс проводят аналогично примеру 1„

ПримерЗ. Из субкультуры штамма Protaminobacter rubrum CBS 51,11 клетки смывают 10 мл стерильной смеси 1 ч. сиропа концентрации б5% и 2 ч. водопроводной воды, содержащей 0,5 г/л (NH),. Эта суспензия служит в качестве прививочного материала для предкультуры в колбах емкостью 1 л с 200 мл питательного - раствора указанного состава, стерилизованного 20 мин при 121°С, находящихся в вибрационных машинах. После в течение 30 ч при

40

культивирования

30 С предварительное культивирование 6 л питательного раствора указанного состава, разлитого по 20 колбам (общий объем t л) , рассеивают в ферментере емкостью 30 л. Ферментируют при 30°С с аэрацией 12 л/мин и при скорости перемешивания 350 об/ /мин.

Выращенные в ферментере 20 л питательного раствора служат в качестве прививочного материала для ферментера емкостью 300 л со l80 л питательного раствора (смесь сиропа с сахарозой и водой с содержанием сухого вещества 25%, чистотой 9б% в расчете на сухое вещество), ферментер работает со скоростью аэрации 200 л воздуха/мин при 30°С и скорости вращения 200 об/ /мин.

После .7 часовой фазы роста добавляют непрерывно со скоростью разбав50

55 ления 0,2 ч питательный раствор

и

равное количество превращенного пита тельного раствора с клетками непрерывно удаляют из ферментера.

915

500 л этого превращенного раствора содержат 2 л клеток (влажные), которые отделяют путем центрифугирования; Концентрация остающегося раствора сое тавляет 23,8% по сравнению с 25% в исходном растворе (потери за счет выдувания части сухого вещества). Количество раствора составляет 498x1,1001 ,8 кг с содержанием сухого вещества 130,+ кг со 101,7 кг изомальтуло зы. После выпаривания до содержания сухого вещества 8й% при 70 С раствор охлаждают до 20 С в кристаллизаторе для охлаждения. Выкристаллизовывающую ся при этом изомальтулозу отделяют центрифугированием от маточного раствора.

Выход. 55,9 кг изомальтулозы с чистотой примерно 99,0%i

Испарение воды на второй стадии кристаллизации 20,k кг. Всю изомальту лозу (88,3 кг) перекристаллизовывают, чтобы повысить чистоту до величины свыше 99,5%. Лля этой цели ее раствр- ряют в 58,9 кг воды. При н;ристаллиза- ции затем эту воду нужно снова выпарить.

Выход: 85,5 кг изомальтулозы с чистотой более 99,5%.,

Испаряемое количество воды: 385+ -..., 20,4+58,,3 ,43 кг на 1 кг ИЗомальтулозы.

в 500 л исходного раствора содержится 138,2 кг сухого вещества (соответствует 132,7 кг сахарозы). Таким образом, выход изомальтулозы составг ляет 64,4% используемой сахарозы.

П р и м е р 4. Фракцию просева 0,3 - 0,8 мм из полученного по примеру 1 препарата размешивают в 0,1%- ном ра створе глутарового альдегида в течение 10 мин, промывают фосфатным буфером 0,1 М, рН 7,0, и путем декантации освобождают от жидкости. Определение ферментативной активности обработанных иммобилизованных клеток показывает удельную активность 60 ед/г сухого вещества. Термостати- руемую колонну заполняют иммобилизованными клетками, так,чтобы объем клеточной массы составил 16 л. Это количество соответствует 6 кг сухого вещества, Зйтем колонну; нагревают до 50°С и через нее непрерывно пропускают 50%-ный раствор сахарозы с нормой расхода 10 л/ч. Выходящий из колонны продукт имеет следующий состав, г/100 г сухого вещества:

Глюкоза

1,4

248910

Фруктоза 4,5

Сахароза О

Изомальтулоза 81,1 1-0-о(.-В-глюкопиранозид-Dфруктоза 13,0

Полученный раствор изомальтулозы при упаривают до концентрации Q 80%, подводят в охлаждающий кристаллизатор, охлаждают до и выкрис- таллизовывают изомальтулозу на фильтрующей корзиночной центрифуге и отде-. ляют от маточника. Маточник при 70°С

0

5

0

5 упадивают до концентрации 80% и в охлажденном кристаллизаторе вновь охлаждают до 20°С. Выкристаллизовавшуюся изомальтулозу на аналогичной центрифуге отделяют от вторичного маточника (мелассы).

В 100 кг выходящего из реактора раствора изомальтулозы содержится 50 кг,сухого вещества, из которых 4Q,55 кг (81,1%) составляют изомальтулозу. Упаривают 37,5 кг воды, чтобы повысить концентрацию до 80%.На 1-й ступени кристаллизации осаждается 22,9 кг изомальтулозы и примерно 0,5 кг промывной воды добавляют при центрифугировании. Получают в результате 40,1 кг маточника с 27,1 кг сухого вещества и 13 кг воды. Чтобы перед 2-й кристаллизацией повьюить концентрацию маточника от 67,6 до 80%, нужно испарить 6,2 кг воды.

На 2-й ступени кристаллизации получают 14 кг изомальтулозы, так что общий выход составляет Зб,9 кг или 91% находящейся в реакторе изома льту лозы (соответствует 73,8% использова- ной сахарозы). Изомальтулоза с 1-й ступени кристаллизации имеет чистоту более 99,5%, и ее можно непосредст-- венно применять дальше. Изомальтулоза с 2-й ступени кристаллизации (14 кг) имеет чистоту более 9б%, и ее еще требуется перекристаллизовать. Для этого ее сначала растворяют в 9,5 кг воды и затем путем упаривания и охлаждения выкристаллизовывают.

Соответственно этому подлежащее упариванию количество воды составляет 37j5+6,2+3,,2 кг для получения Зб,9 кг изомальтулозы или 1,44 кг/кг изомальтулозы,

П р и м е р 5. Фракцию просева 0,3-0,8 мм из полученного по примеру 1 препарата перемешивают в 0,1%-ном растворе глутарового альдегида в те5

0

0

5

чение 10 мин, промывают фосфатным буфером 1,0 М, рН 7,0, и путем /зеканта- ции освобождают от воды,. Определение ферментативной активности у обработ, тайных иммобилизованных клето к показывает удельную активность 60 ед/г сухого вещества. Термостатируемую колонну заполняют, иммобилизованными клетками, так чтобы объем клеточной массы составлял 1б л. Это количество соответствует 6 кг сухого вещества. Затем колонну нагревают до kQ°C и через нее непрерывно пропускают 50%-ный раствор сахарозы с нормой расхода 10 л/ч. Выходящий из колонны продукт имеет следующий состав, г/100 г сухого вещества:

Глюкоза 2,5 Фруктоза А, 5 Сахароза 0,6 Изомальтулоза 82,5 1 -O-ui-D-глюкопи- ранозид-1)-фрук- тоза9,9

Полученный раствор изомальтулозы кристаллизуют по описанной в примере схеме.

Из 100 кг раствора изомальтулозы получают 37, t кг изомальтулозы (соответствует выходу 7,8% в расчете на использованное количество сахарозы). Подлежащее упариванию количество воды составляет 53,2 кг для получения 37, кг изомальтулозы или 1,2 кг/кг изомальтулозы,

П р и м е р 6. От перевивки штамма Serratia plymuthica АТСС 15928 смывают клетки с помощью 10 мл стерильной питательной среды,состоящей из 8 кг сиропа с завода по производству сахара, концентрации 65, 2 кг воды от набухания кукурузы, 0,1 кг (N1-14)2НРО и 89,9 кг дистиллированной воды (при необходимости рН устанавливают 7,2), Эта суспензия служит в качестве затравочного материала для предкультур в вибрационных колбах емкостью 1 л с 200 мл питательного раствора указанного состав.а.

После термостатирования в течение 30 ч при проводят инокуляцию с помощью 20 колб (. л) 1б л питател ной среды указанного состава в ферментере емкостью 30 л и ферментируют при с аэрацией 20 л воздуха/мин и при скорости перемешивания 350 об/мин. Возросшее количество микроорганизмов определяют микроскопи

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

ческим методом. После достижения по меньшей мере 5x10 микроорганизмов/мл ферментацию заканчивают.

Содержимое ферментера переводят в другую емкость (сосуд), где смешивают с катионоактивным коагулянтом (как например, PRIMAFLOC® С7:.. фирмы Rohm and Haas, Филадельфия, США). Скоагулированные клетки удаляют путем декантации надосадочной жидкости,промывают с помощью 0,1 М фосфатного буфера с рН 7,0 и обезвоживают на центрифуге. Затем массу экструдйруют до получения прядей, высушивают на воздухе и размалывают.

60 г просеянной через сито размером 0,3-0,8 мм фракции из полученного препарата в течение 10 мин перемешивают в 0,1%-ном растворе глутарового альдегида, промывают фосфатным буфером 0,1 М, рН 7,0, и декантацией освобождают от надосадочной жидкости. Определение ферментной активности таким образом обработаннь1х иммобилизованных клеток показывает удельную активность 40 ед/г сухого вещества,. Иммобилизованные клетки вносят в Термостатируемую при 5°С колонну. Объем слоя клеточноймассы составляет примерно 1бО см, Через колонки непрерывно протекает раствор сахарозы со скоростью потока 70 . Выходящий из колонки поток продукта имеет следующий состав, г/100 г сухого вещества:

Глюкоза3,4,

Фруктоза5,7

Сахароза, ; 1,3

Изомальтулоза 74,4 1-0-р6-В-глюкопирано- зид-В-фруктоза 15,2 Полученный раствор изомальтулоэы кристаллизуют соответственно описанной в примере 4 схеме. Из 50 кг раствора изомальтулозы получают 17,3 кг изомальтулозы (соответствует выходу б9,2 в расчете на использованное количество сахарозы).

П р и м е р 7. Ситовую фракцию 0,3-0,8 мм из полученного согласно примеру 1 препарата перемешивают в течение 30 мин в 0, растворе цианурхлорида (2,4,6-трихлор-симм,- трйазин), промывают фосфатным буфером 0,1 М, рН 7,0 и путем декантации.освобождают от надосадочной жидкости. Определение ферментной активности таким образом обработанных иммобилизованных клеток показывает удельную активйость 55 ел/г сухого вещества, В термостатируемую при 40°С колонку вносят столько иммобилизованных кле- ток, чтобы объем слоя клеточной масс составил 1бО см. Это количество соответствует 60 г сухого вещества. Через колонку затем непрерывно пропускают 50%-ный раствор сахарозы со скоростью потока 30 . Выходящий из колонки поток продукта имеет следующий состав, г/10О г сухого вещества:

.; Глюкоза2,7

Фруктоза3,9

Сахароза0,7

Изомальтулоза 79,9 1-O-oi-D-глюкопиранозид- D-фруктоза12,8

Полученный таким образом раствор изомальтулозы кристаллизуют соответственно описанной в примере 4 схеме.

Из 50 г раствора изомальтулозы получают 17,8 кг изомальтулозы. Это .соответствует выходу 71,2.% в расчете на использованное количество сахарозы,

Пример8, Из полученного согласно примеру 6 ферментного раствора получают клеточную массу с помощью центрифуги. Эту клеточную массу перемешивают в 8%-ном растворе альгината натрия в соотношении 1 ч, клеточной массы на 10 ч, раствора альгината. Полученную таким образом суспензию пропускают через фильеры диаметром 0,8 мм в медленно перемешиваемый 2%- ный раствор хлорида кальция. При это образуются гранулы (шарики) альгината кальция, которые содержат включенные клетки бактерий. Измерение ферментной активности гранул (шариков) показывает удельную активность 87 ед/ сухого вещества.о В термостатируемую при 40°С колонку вносят 1бО см гранул (шариков). Это количество соответствует 45 г сухого вещества. Чере колонку непрерывно пропускают 50%-ны раствор сахарозы со скоростью потока 50 . Выходящий из колонки поток продукта имеет следующий состав, г/100 г сухого ,,вещества: Глюкоза2,1

Фруктоза4,3

Сахарова2,0

Изомальтулоза 78,3 . 1-0-о6-В-глюкопира- нозид-В-фруктоза 13,3

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

Полученный раствор изомальтулозы .: кристаллизуют соответственно описанной в примере 4 схеме,

14з 50 кг раствора изомальтулозы получают 17,6 кг изомальтулозы. Это соответствует выходу 70,4% в расчете на использованное количество сахарозы,

П р и м е р 9. Перевивку штамма Protaminobacter rubrum CBS 574,77 ферментируют аналогично примеру 6, Содержимое ферментера смешивают с 2%-ным раствором хитозана, Скоагу- лированную при этом клеточную массу обеавоживают на центрифуге, экструди- руют до полученния прядей и высуижва- ют. Затем массу размалывают и просеивают. Ситовую фракцию 0,3-0,8 мм перемешивают в течение 30 мин в 0, растворе цианурхлорида (2,4,6-три- хлор-симм,-триазин) промывают фосфатным буфером 0,1 М, рН 7,0, и отделяют от надосадочной жидкости декантацией. Определение ферментной активности обработанных таким образом иммобилизо- ванных клеток показывает удельную активность б5 ед/г сухого вещества, В термостатируемую при 40°С колонку вносят столько иммобилизованных клеток, чтобы объем слоя клеточной массы составил 1бО смЗ. Это количество соот-. ветствует 50 г сухого вещества. Через колонку затем непрерывно пропускают раствор сахарозы со скоростью потока 60 смз/ч. Выходящий из колонки поток продукта имеет след ующий состав, г/ЮО г сухого вещества: Глюкоза1,3

Фруктоза3,2

Сахароза1,2

Изомальтулоза 80,6 1-0-сх1-В-глюкопирано- зид-В-фруКтоза 13,7 Полученный раствор изомальтулозы кристаллизуют соответственно описанной в примере 4 схеме.

Из 50 г раствора изомальтулозы получают 18,1 кг изомальтулозы. Это . соответствует выходу 72,4% в расчете на использованное количество сахарозы,

П р и м е р 10, Перевивку штамма Protaminobacter rubrum CBS 574,77 ферментируют аналогично примеру 6, ,

Содержимое ферментера переводят в другой сосуд, смешивают с водным раствором коагулянта, состоящим из . катионоактивного коагулянта PRIMAFLOCS С7 фирмы Rohm and Haas, Филадельфия, ;

1 5

США) и анионоактивного коагулянта PRIMAFLOC AIO фирмы Rohm and Haas, Филадельфия CUJA, Скоагулировавшие клетки осаждают, декантируют, промывают с помощью 0,1 Н фосфатного буфера, рН 7,0, и обезвоживают на центриг фуге. Массу затем экструдируют .в жгуты, сушат при 30°С и размалывают. 100 г ситовой фракции 0,,8 мм полученного препарата перемешивают . в течение 10 мин в растворе глутарового альдегида, промывают фос- ;фатным буфером (0,1 К, рН 7,0) и путем декантации освобождают от надосадочной жидкости. Обработанные клетки имеют удельную активность б5 ед./г сухого вещества.

Иммобилизованными клетками заполоняют термрстатируемый при 30°С коло- ночный реактор. Объем слоя клеточной мдссы составляет примерно 300 см. Через реактор непрерывно пропускают раствор сахарозь со скоростью протекания 180 . Выходящий из реактора поток продукта имеет следующий состав, г/100 г сухого вещества:

Глюкоза3 ,.1

Фруктоза 9

Сахароза0,8.

Изомальтулоза 81,5

1-0-1,-В-глюкопира

нозидо-1)-фруктоза 9,7

Полученный раствор изомальтулозы кристаллизуют соответственно описан- ной в примере k схеме.

Из 50 кг раствора изомальтулозы получают 18,3 кг изомальтулозы. Это соответствует выходу 73,2% в расчете на использованное количество розы. ,

Изобретение обеспечивает следующие преимущества: раствор, содержащий изомальтулозу, можно подвергать крис-:45 таллизации без предварительного выпаривания, благодаря чему достигается значительная экономия энергии; применение иммобилизованных клеТок повышает выход изомальтулозы, так как caxa-jjo щ и и с я тем, что используют иммобилизованные клетки, включенные в К-каррагинановый гель.

7. Способ по п.1, отличающий с я тем, что используют иммо- 55 билизованные клетки, включенные в

волокна диацетат или триацетат цег1лю- лозы.

роза не расходуется для обмена ществ бактериальной массы; выход изомальтулозы еще более повышается вследствие того, что вводят чистые растворы сахарозы и поэтому избегают обширного образования мелассы; так как растворы сахарозы с концентрациями выше 65% микробиологически стабильны, то можно исключить стерилиза8. Способ по п.1, отличающий с я тем, что используют иммо

16

субстрата; более высокие концент0

-

0

5

0

5

5

рации субстрата можно вводить в мень-. шем объеме и, таким образом, можно использовать аппаратуру меньших размеров; увеличение бактериальной массы для получения неподвижных клеток происходит при оптимальных условиях развития; для приготовления бактериальной массы можно применять дешевый питательный субстрат, например разбавленный мелассовый раствор.

Формула изобретения

1. Способ получения изомальтулозы, предусматривающий ферментативную изомеризацию раствора сахарозы с помощью клеток Protamtnobacter rubrum CBS 574,77 или Serratia plymuthica с последующим выделением и кристаллизацией целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и чистоты целевого продукта, изомеризацию осуществляют с использованием иммобилизованных клеток культур Protaminobacter rubrum CBS, 574.77 или Serratia plymuthica АТСС 15928, или S. maycescens NCIB 8285 путем непрерывного пропускания kS 75%-ного раствора сахарозы через реактор с иммобилизованными клетками при itO-65°C,

2 Способ по. п. 1 , отличаю- щ и и с я тем, что используют иммобилизованные клетки, полученные коагуляцией глутаровым альдегидом или хлористым циануром.

3. Способ по п,1,отличающий с я тем, что используют иммобилизованные клетки, полученные коагуляцией катионоактивным коагулянтом.

4. Способ по пп Л иЗ, отличаю щ и и с я , что в качестве коагулянта используют хитозан.

5.Способ поп.1,отличаго- щ и и с у тем, что используют иммобилизованные клетки, включенные в матрицу из альгината- кальция.

6.Способ поп.1,отличаю8. Способ по п.1, отличающий с я тем, что используют иммо17151248918

билизованные клетки, полученные коа- активным коагулянтом или их комбина- гуляцТ ей анионоактивным или катионе- цией..

Изобретение относится к биотехнологии, касается непрерывного преобразования сахарозы в изомальтулозы и может найти применение в пищевой промышленности в качестве сахарозаменителя. Цель изобретения - повышение выхода и чистоты целевого продукта. Способ предусматривает ферментативную изомеризацию 45-75% раствора сахарозы путем пропускания его через реактор с иммобилизованными клетками PROTAMINOBACTER RUBRUM CBS 57477 или SERCATIA PLYMUTHICA ATCC 15928 или S.MARCESCENS NCIB 8285 при температуре от 40 до 65°С. Для иммобилизации клеток в основном пригодны все методы приведения в неподвижность клеток. Благодаря двухступенчатой кристаллизации получают в кристаллической форме до 91,5%, имеющейся в растворе изомальтулозы. 7 з.п. ф-лы.