Декапептид, обладающий липотропной активностью Советский патент 1983 года по МПК C07K14/67 A61K38/08 C07K14/61 

00 Э Изобретение относится к новому биологически активному соединениюдекапептиду, обладающему липотропной активностью, которое может .применение в медицине в качестве; жиромобилиэующего препарата. Известно, что соматотропный гормон обладает липолитической активностью 1 . Известен тетрадекапептид последовательности 31 оматотропного гормона человека формулы HLPhe-Ь-С,еu-U-Greu-L-AEa-L-T-yr-It-Dee-b-Pro-L-Lye-U-Qeu-U-Cieyi-L-LvS-b-TvH-L-c,ev-u-PV)eoH обладаюи1ий высокой липотропной актив ностью Недостатками указанного тетрадека пептида являются сложная структура (1 .аминокислотных остатков;) и много стадийный синтез. Цель изобретения - расширение арсенал а средств, влияющих на жировой обмен в тканях животных. Поставленная цель достигается согласно изобретению декапептидом формулыHLTvr-b-aee-L-Pro-b-Lvs-b-Qeu-b-Gevi-Ь )у- - Vi-Ser- L.-PlieOH обладающим липотропной активностью. Предлагаемый дек,апептид получают твердофазнымМетодом синтеза с использованием в качестве полимерного носителя хлорметилированного со полимера стирола с дивинилбензолом путем ступенчатого наращивания пептидной цепи.. На чертеже представлена схема син теза декапептида. Принятые сокращения: СР) - полимерный носитель. Вое - трет-бутилоксикарбонил,Z-бензилоксикарбонил, BZ - бензил, ONP - п-нитрофениловый эфир. В синтезе использованы следующие производные LS-аминокислот (фирма Реанал ВНР): трет-бутилоксикар бонид СБОК)-фенилаланин; N-БОК-О-бен зил-серин, N-BOK-0-бензил-тирозин, N-BOK-N -карбобензоксилизин, п-нитрофениловый эфир N-БОК-глутамина, у-бензиловый эфир N-БОК-глутаминовой кислоты; N-БОК-пролин и N-БОК-изолейцин. В качестве нерастворимого носителя при синтезе декапептида использован, сферический хлорметилированный сополимер стирола с 2% дивинилбензола (содержание хлора 2 ммоль/г полимера). Реакции конденсации проводят с применением в качестве конденсирующего агента дициклогексилкарбодиимида (ДЦПГ); единственное исключение присоединение остатка глутамина, который в пептидную цепь вводят методом п-нитрофениловых эфиров. Снятие пептида с полимерного носителя и его исчерпывающее деблокирование проводят действием бромистого водорода в трифторуксусной кислоте в присутствии анизола. Сырой продукт после снятия с полимера-носителя переосаждают из метанола эфиром, хроматографируют на колонке с целлюлозой в среде н-бутанол-вода-пиридин-уксусная кислота (15:12:10:3) и лиофилизируют. Чистоту полученного Препарата контролируют бумажной хроматографией (БХ) на ватмане ММ № 3 и тонкослойной хроматографией (тех) на пластинках Силуфол (ЧССР) в системах н-бутанол-вода-пиридин-уксусная кислота (15:12: :10:3) (система А), этилацетат-пиридин-уксусная кислота-вода (5:5:1 3) (система Б), изоамиловый спирт-пиридин-вода-уксусная кислота (7:8:6:2) (система В), а также определением N-концевых аминокислот по методу Эдмана и аминокислотным и элементым анализами. Основные этапы синтеза декапептида 1 следующие: присоединение С-концевой аминокислоты к полимеру-носителю; наращивание полипептидной цепи на полимере; отделение декапептида от полимера-носителя с одновременным удалением защитных групп; очистка декапептида с последующей характеристикой его физико-химических и липотропных свойств. Присоединение С-концевой аминокислоты к полимеру-носителю. Перемешивают в течение 18 ч при кипячении смесь ,3 г (16 ммоль) БОК-фенилаланина, 8 г полимера-носителя и 2,016 мл (13 ммоль) триэтиламина в 5 мл этилацетата. Далее реакционную смесь охлаждают до , полимер отфильтровывают, последовательно промывают этилацетатом, этанолом, водой, этанолом, диоксаном, обрабатывают ,7 н. раствором хлористого водорода в диоксане, промывают диоксаном и эфиром и сушат в вакууме

над . Для определения количества аминокислоты на полимере 18 мг полученного фенйлаланил-полимера гюцвергают гидролизу при в течение 5 ч в смеси 12 н. НС и пропионовой кислоты (по 2 мл) и фильтруют. По данным аминокислотного анализа фильтрата после его упаривания количества БОК-фенилаланина на полимереносителе составляет ммоль/т.

Наращивание полипептидной цепи на полимерном носителе.

Для построения полипептидной цепи на полимере БОК-фенилаланин-полимер (6,37 г; содержание аминокислоты 6,27 ммоль) последовательно подвергают девять раз следующему циклу обработок соответствующими растворителями и реагентами ( количество растворителей при каждой обработке 60 мл7 : а) промывка диоксаном, 2x3 мин, б) обработка Ц,7 н. хлористым водородом в диоксане 1 х 30 ми .в) промывка диоксаном, 3 х 3 мин; г)промывка хлористым метиленом, 2 X 3 мин д) обработка 10%-ным раствором триэтиламина в хлористом метилене, 1 X 10 мин; -е) промывка хлористым метиленом,- 4x3 мин; ж) добавление 18 ммоль соответствующей БОК-аминокислоты, начиная с N-БОК-О-бензил-серина, в хлористом метилене з) внесение в реакционную смесь 9 ммоль ДЦГК (начало конденсации); и) через 30 мин добавление еще 9 ммоль ДЦГК; к) через 60 мин промывка хлористым метиленом, 3x3 мин (окончание конденсации); обработка смесью ; 2 мл уксусного ангидрида и 1 мл .триj этиламина в хлористом метилене для блокирования возможных свободных аминогрупп, .не вступивших в реакцию конденсации, 1 X 30 мин (далее цикл повторяется с новой БОК-аминокислртой).

При введении в пептидную цепь остатка глутамина методом п-нитрофениловых эфиров ( продолжительность ,, конденсации 18ч) на стадии 6 вместо хлористого метилена используют диметилформамид, конденсацию также ве дут в диметилформамиде, а стадии з) и и) исключают.

По окончании наращивания пептидной цепи полученный защищенный декапептид-полимер промывают этанолом, уксусной кислотой и эфиром и сушат в вакууме над .

Отделение декапептида от полимера-носителя с одновременным удаление защитных групп о

Барботируют в течение 90 мин бро-, мистый водород через суспензию 2 г защищенного декапептид-полимера в 20 мл трифторуксусной кислоты, 20 ил хлористого метилена и 2 мл анизола. Затем полимер отделяют фильтрацией, промывают трифторуксусной кислотой (2x10 мл), и объединенные фильтраты упаривают при . Остаток растворяют в смеси 20 мл метанола и 5 мл диметилформамида и переосаждают добавлением kS мл эфира. Осадок отделяют центрифугированием, промывают эфиром, снова центрифугируют и сушат. Получают 1 г сырого продукта.

Очистка декапептида t. .

0,308 г сырого продукта растворяют в 2 мл смеси н-бутанол-уксусная кислота-вода-пиридин (15:3:12:10), и раствор наносят на колонку (25 х 3 см заполненную суспензией целлюлозы (Filtrak-KND) (ГДР) в той же смеси растворителей. Указанную смесь растворителей используют далее в процессе элюирования вещества с колонки; Разделение контролируют с помощью тех а пластинках Силуфол в системе А. Фракции, содержащие основноевещ естч во, объединяют и лиофилизируют. Получают 0,171 г С выход 50 в расчете на С-концевую аминокислоту) декапептида в виде белого твердого вещества с т.пл. 193-195 С (разл.,(о1) -73, с 0,37; . н. .R$ 0,50 (БХ в системе А), 0,tl (ТСХ в системе А, 0,51 СТГ.Х в системе Б), 0,31 ГГСХ в системе В) , Элементный анализ. Найдено,: С 53,5,1; Н 7,07; М11,23

, ДЛ СН,СООН.Н2.0 : Вычислено, С 58,51; Н 7,07;

: 11,11.

Аминокислотный анализ, %i Р 1 0 С1,00) 1,00 (1,00); 1,63 2,0(1) 1,8i (2,00); Pro 1,00 :(1 ,00); 31е 0,90 (1,00); Glu 2,17 (2,00).. .

Проводят биологические испыта ния предлагаемого декапептида.

Испытание имеет целью определить влияние синтетического декапептида , . на скорость липолиза у кроликов in vivo и in vitro и провести сравнение липотропного действия описываемого декапептида и известных соединений - соматотропина человека и синтетического тетрадекапептида. Изучение липотропного действия декапептида. В опытах In vivo липотропную активность определяют по увеличению концентрации неэтерифицированных жи ных кислот (НЖК) в плазме крови животных после введения им поепаоатов Кроликам (вес 2000-2500 г) .после 2k ч голодания вводят внутримышечно препарат в 0,5 мл физиологического раствора. Контрольным животным вводят чистый физиологический раствор. Каждая группа животных состоит из 6 кроликов. Пробы крови отбирают из уш ной вены до введения и через 30 мин после введения декапептида и тетрадекапептида или через мин после введения соматотропина, так как его липотропное действие требует длитель ного латентного периода. Уровень НЖК в крови определяют по методу Фолхолта. Результаты влияния декапептида на скорость липолиза у кролика in vivo приведены в табл. 1. лица , В опытах in vitro кусочки околопочечной жировой ткани кроликов весом 80 мкг измельчают ножницами и инкубируют в 2 мл бикарбонатного буфера КреЬса-Рингера, содержащего 3% бычьего сывороточного альбумина, при 37 С.в атмосфере карбогена (95% 0 С0.2) в течение 120 мин.Опыт ная контрольная группы состоят из 5 кроликов. В опытные пробы добавляют по 0,1 мл физиологического раствора, содержащего испытуемые дозы декапептида или тетрадекапептида, в контрольные пробы - по 0,1 мл физиологического раствора. По окончании инкубации в 5 мкл инкубационной смеси определяют содержание НЖК по методу. Фолхолта с помо1цью калйбро-. вочной кривой, построенной по пальмитиновой кислоте. Результаты влияния декапептида I на скорость липолиза в жировой ткани клопика in vitro представлены в табл. 2. Таблица2

Декапептид форму/ш iH-u-Tsr-u-ige-u-Piro-v-Uss-i.-Geu-ti-Gien-Vi-x-vs-u-T r-u-ser-u-Phe он обладающий липотропной активность. i

Физиологический раст К онцентрацию НЖ в плазме кр ви определяют в опытах ff 2 и через 30 мин после введения препаратов, а в опыте № k рез мин. Липотропную активность In v|tro оценивйют по стимуляции липолиза в изолированной околопочечной жировой ткани кролика, инкубируемой в присутсГтвии декапептида. Лекапептид,тетрадекапептид исоматотропин в опытах in vivo увеличивают уровень НЖК в плазме крови кроликов соответственно на , и . Таким образом, в условиях in vivo декапептид и тетрадекапептид обладают примерно равным эффектом, значительно превышающим липотропное действие соматотропина. и опытах in vitro декапептид формулы I и тетрадекапептид формулы П также обладают примерно равным липотропным действием, увеличивая концентрацию НЖК в инкубационной среде соответственно на и . Предлагаемый декапептид формулы I рбладает липотропной активностью, соНоставимой с активностью тетрадекапептида, и значительно превосходит по активности СТГ. Однако в отличие . от известного тетрадекапептида пред71лагаемый декапептид имеет более прос тое строение, так как является более коротким пептидом и содержит в своем составе только 10 аминокислотных остатков. Проводят испытания на токсичность описываемого декапептида. Токсичность декапептида исследуют в острых опытах f острая токсичность) на трех видах животных и в хроническом опыте (хроническая ток . сичность) на одном виде животных. ; Определение острой токсичности : Оструютоксичность декапептида проверяют на крысах, мышах и морских 1 свинкахо. При испытании на крысах-самцах линии Вистар весом 110-120 г(10крыс). ,и весом.50 г (10 крыс) декапептид вводят одноразово внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг веса в 0,5 мл физиологического раствора. Указанная доза Значительно превышает активную дозу препарата у крыс С 1 мкг/кг веса). В указанной дозе препарат не ока зывает. местного раздражащего действия и не изменяет внешнего состояния и поведения животных. При забое живот ных через сутки введения препарата каких-либо уплотнений ,инфильтратов в местах введения не выявлено. Токсических измеТ|ёний в органах и тканях не наблюдается. При испытании на мышах-самцах весом 20 г 10 мьнией) декапептид вводят одноразово внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг веса тела, в 0,5 мл физиЬлогического раствора. Животных Сбивают через сутки после введения препарата. Токсических изменений раздражения,уплотнений,инфильтратов в мебтах введения, изменения поведе ния и состояния животных после введения препарата, а также изменений в органах и тканях не обнаружено. При испытаниях на морских свинках-самках весом 180-200 г tlO жи2вотных ) декапептид вводят одноразово внутриЬрюшинно в дозе 25 мг/кг веса в 0,5 мл физиологического раствора. Животных забивают через сутки после введения препарата,Раздражения, уплотнения или инфильтратов в местах введения препарата не обнаружено, изменения поведения и состояния животных после введения препарата не наблюдается, токсических морфологических изменений в органах и тканях не выявлено. Определение хронической токсичности . Испытание проводят на мышах-самцах весом 20-25 г (исходный), К концу опыта вес мышей возрастает до 26-35 Ti 1екапептид вводят внутрибрюшинно 15 раз в течение 3 недель в общей дозе 600 мг/кг веса тела одноразовая доза kQ мг/кг веса в день). Животных забивают на следующий день после последнего введения препарата под эфирным наркозом. Контролем служили интактные мыши того же возраста. Число мышей в контрольной и опытной группах равно 10. Раздражений, уплотнений, инфильтратов в местах введения не обнаружено. Поведение и внешний вид опытных животных в течение Э1Л;перимента не отличались от таковых у контрольных мышей того же-помета, не получавших препарата. В удаленных после аутопсии органах и тканях морфологических изменений не выявлено. Данные измерения веса отдельных органов и тканей мышей, получавших в течение 3 недель декапептид, представлены в табл, 1. в общей дозе, в 40 раз превышаюидей активную дозу препарата, при введе-« НИИ декапептида не обнаружено статистически достоверных различий в весе различных органов и тканей животных, получивших декапептид, и контрольных животных.

Вое

IMC