N-[2,2-ДИМЕТИЛ-1S-(ПИРИДИН-2-ИЛКАРБАМОИЛ)ПРОПИЛ]-N-ГИДРОК СИ-2R-ИЗОБУТИЛ-3S-МЕТОКСИСУКЦИНАМИД ИЛИ ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ПРИЕМЛЕМАЯ СОЛЬ, ГИДРАТ ИЛИ СОЛЬВАТ Российский патент 2003 года по МПК C07D213/75 A61K31/4402 A61P17/06 A61P19/02 A61P35/00 A61P37/00 

Описание патента на изобретение RU2198164C2

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В международной заявке WO 95/19956 (British Biotech Pharmaceuticals Ltd) описан и заявляется класс соединений, являющихся ингибиторами матриксных металлопротеаз (ММП) и ингибиторами выделения фактора, вызывающего некроз опухолевых клеток (TNFa) из клеток. Конкретно, заявка раскрывает соединения общей формулы (I)

в которой Х обозначает группы -СО2Н или -CONHOH;
R1 обозначает водород; (С1С6)алкил; (С26)алкенил; фенил; замещенный фенил;
фенил(С16)алкил; замещенный фенил(С16)алкил; гетероциклический остаток; замещенный гетероциклический остаток; гетероцикло(С16)алкил; замещенный гетороцикло(С16)алкил; группу ВSОnА, где n обозначает 0, 1 или 2, В обозначает водород или (С16)алкил, фенил, замещенный фенил, остаток гетероцикла, (С16)ацил, фенацильную или замещенную фенацильную группу и А представляет собой (С16)алкил; амино; защищенная аминогруппа; ациламино; ОН; SH; (С16)алкокси; (C16)алкиламино; ди(С16)алкиламино; (С16)алкилтио; арил(С16)алкил; амино(С1- С6)алкил; гидрокси(С16)алкил; меркапто(С16)алкил или карбокси(С16)алкил, где амино-, гидрокси-, меркапто- или карбоксильная группа при необходимости являются защищенными или карбоксильная группа находится в виде амидной; низший карбамоилзамещенный алкил, моно(низший алкил)карбамоил, ди(низший алкил)карбамоил, ди(низший алкил)амино или карбокси-низший-алканоиламино;
R2 обозначает (С16)алкил, (С26)алкенил, (С26)алкинил, фенил(С16)алкил, гетероарил(С16)алкил, циклоалкил(С16)алкильную или циклоалкенил(С16)алкильную группу, любая из которых при необходимости может иметь один или более заместителей, выбранных из (С1С6алкильной, -O(С16)алкильной, -S(C16)алкильной, галоген- или циано (-CN) групп;
R3 обозначает характеристическую группу природной или синтетической α-аминокислоты, в которой любые функциональные группы можно защитить;
R4 обозначает фенильный или 5- или 6-членный гетероарильный цикл, где любой атом азота в цикле может быть окислен до N-оксида, который при необходимости может соединяться с бензольным кольцом или 5-, 6- или 7-членным гетероциклическим кольцом, где любой из циклов может при необходимости быть замещенным с:
(а) одним или более заместителем независимо выбираемым из групп: гидроксил, галоген, -CN, -СО2Н, -СO216)алкил, -(С16)алкил-СO216)алкил,
-CONH2, -СОNН(С16)алкил, -СON(С16)алкил)2, -СНО, -CH2OH, -(С1-C4)перфторалкил, -O(C16)алкил, -SO(С16)алкил, -S(С16)алкил,
SO216)алкил, -NO2, NH, -NH(C16)алкил, -Н(С16)алкил)2 и -NНСО(С16)алкил или
(б) группой, выбираемой из (С16)алкильной, (С26)алкенильной, (С26)алкинильной, (С38)циклоалкильной, (С46)циклоалкенильной, фенильной, бензильной, гетероарильной или гетероарилметильной, причем любая из этих групп может при необходимости иметь один или более заместителей, выбираемых из галогена, гидроксила, амино-, карбоксильной, (С14)-перфторалкильной, (С16)алкильной, -O(С16)алкильной или S(С16)алкильной группы;
R5 обозначает водород или (С16)алкильную группу,
или их соль, гидрат или сольват.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
N1-[2,2-Диметил-1S-пиридин-2-илкарбамоил)пропил] -N4-гидрокси-2R-изобутил-3S-метоксисукцинамид является представителем класса, описываемого и заявляемого в общем в международной заявке WO 95/19956, но ни он, ни его свойства конкретно не охарактеризованы.

В международной заявке WO 95/19956 утверждается, что в описываемом классе соединений ароматический или гетероарильный заместитель R4 вызывает в общем неожиданный и желаемый эффект увеличения активности по отношению к стромелизину по сравнению с известными соединениями практически аналогичного строения, но имеющими другие (обычно метальные) заместители R4, при сохранении активности в отношении коллагеназы и желатиназы. Будучи представителем этого класса, выбранное в данном случае соединение N1-[2,2-диметил-1S-(пиридин-2-илкарбамоил)пропил]- N4-гидрокси-2R-изобутил-3S-метоксисукцинамид обладает этими свойствами.

Однако известно, что некоторые ингибиторы ММП вызывают побочный эффект, мышечную боль (также иногда называемую тендинитом) в суставах, например в плечевом, у некоторых животных и людей, после высоких и/или пролонгированных доз. Хотя считается, что этот эффект является практически обратимым при прекращении приема, он, тем не менее, нежелателен. Механизм возникновения боли до настоящего времени непонятен, и далеко не кажется возможным коррелировать предрасположенность соединения вызывать боль с конкретными особенностями строения молекулы или с ее профилем ингибирования фермента. Соответственно, нельзя заранее предсказать, будет ли какой-либо данный ингибитор ММП вызывать побочный эффект и, в случае его появления, тяжесть этого эффекта, и это нужно определять эмпирически.

В настоящее время найдено, что выбранный N1-[2,2-диметил-1S-(пиридин-2-илкарбамоил)пропил] -N4-гидрокси-2R-изобутил-3S-метоксисукцинамид обладает резко пониженной тенденцией вызывать побочный эффект - мышечную боль. В этом отношении он отличается от близких по строению аналогов, например N1-[2,2-диметил-1S-(пиpидин-3-илкapбaмoил)-пpoпил] -N4-гидpoкcи-2R-изoбyтил-3S-гидpoкcисукцинамида, более склонного вызывать этот побочный эффект.

В заявке WO 95/19956 также утверждается, что описываемый класс ариламидных ингибиторов ММП включает соединения, которые являются биодоступными при пероральном приеме. Не все соединения, охватываемые заявкой WO 95/19956, являются биодоступными в приемлемой степени при пероральном введении, что доказывается, например, уровнем пика ММП-ингибиторной активности, или уровнем активности во времени ("площадь под кривой"), отнесенным к лекарственному препарату крови животных при пероральном его введении. Было найдено, что соединение, выбранное в соответствии с данным изобретением, N1-[2,2-диметил-1S-(пиридин-2-илкарбамоил)пропил] -N4-гидрокси-2R-изобутил-3S-метоксисукцинамид при пероральном введении является биодоступным в организме человека и в организме других млекопитающих.

Это сочетание пероральной доступности и пониженной склонности вызывать тендинит в качестве побочного эффекта предполагает, что соединение по изобретению должно иметь относительно обширную область применения в терапии для лечения заболеваний, требующих системного введения ингибитора ММП в течение умеренного или более длительного времени. Следовательно, соединение показано для лечения, например, ревматоидного артрита, злокачественных опухолей, рассеянного склероза (PC), синдрома Гийена-Барре-Штроля (ГБС) и псориаза.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Следовательно,данноеизобретениепредставляетсобойN1-[2,2-диметил-1S-(пиридин-2-илкарбамоил)пропил] -N-гидрокси-2R-изобутил-3S-метоксисукцинамид формулы II

и его фармацевтически приемлемые соли, гидраты и сольваты.

В соединении по изобретению имеются три асимметрических атома углерода, стереохимическая конфигурация которых отражена в названии соединения и проиллюстрирована формулой (II). Однако следует понимать, что изобретение включает смеси энантиомеров соединения (II) при условии, что названный энантиомер преобладает. Предпочтительно, чтобы в такой энантиомерной смеси 90 вес.% или более составлял названный энантиомер.

Соли соединения по изобретению включают физиологически приемлемые соли, получающиеся при присоединении кислот, например гидрохлорид, гидробромид, сульфат, метансульфонат (мезилат), n-толуолсульфонат (тозилат), фосфат, ацетат, цитрат, сукцинат, лактат, тартрат, фумарат и малеат. Соли могут образовываться с основаниями, например натриевые, калиевые, магниевые и кальциевые соли.

Выбранные соединения по изобретению можно получать представленным в примере данного описания способом и можно вводить любым способом, согласующимся с его фармакокинетическими свойствами. Вводимые перорально композиции могут быть в форме таблеток, капсул, порошков, гранул, лепешек, жидких или гелеобразных препаратов, таких как растворы или суспензии для перорального, местного применения или стерильные растворы или суспензии для парентерального введения. Таблетки и капсулы для перорального введения могут быть в виде стандартной дозы и могут содержать подходящие эксципиенты, такие как связующие, наполнители, смазки для таблетирования, расщепляющие вещества или приемлемые увлажнители. Таблетки могут покрываться оболочкой способами, хорошо известными в обычной фармацевтической практике. Жидкие препараты для перорального введения могут быть, например, в виде суспензий в воде или в масле, растворов, эмульсий, сиропов или эликсиров или могут быть в сухом виде и перед употреблением смешиваться ("воссоздаваться") с водой или другим подходящим носителем. Такие жидкие препараты могут содержать соответствующие добавки, такие как суспендирующие агенты; эмульгаторы; неводные носители (которые могут содержать пищевые масла); консерванты и при необходимости соответствующие вкусовые добавки и красители.

Активные ингредиенты могут также вводиться парентерально в стерильной среде. В зависимости от применяемого носителя и концентрации лекарственный препарат может суспендироваться или растворяться в носителе. Адъюванты, например такие, как анестетики для местной анестезии, консерванты и буферизаторы, могут растворяться в носителе.

Доза соединения по изобретению при любом данном клиническом показании и при данном способе введения определяется клиническими испытаниями в соответствии с обычной практикой при условии одобрения соответствующими властями. В целом, в настоящее время полагают, что соединение следует вводить человеку перорально в дозировке 5-100 мг два или три раза в день.

Следующий пример описывает получение соединения по изобретению. Исходные вещества - 2R-(2,2-диметил-5-оксо[1,3]диоксолан-4S-ил)-4-метилпентановую кислоту и L-трет-лейцин-N-(2-пиридил)амид - получают, как описано в международной заявке WO 95/19961.

В примере используются следующие сокращения:
ДМФА - N,N-диметилформамид,
EDC - гидрохлорид N-этил-Nу-(3- диметиламинопропил)карбодиимида,
HOBt - 1-гидроксибензотриазол,
NMM - N-метилморфолин,
ТГФ - тетрагидрофуран.

ПРИМЕР
N1-[2,2-Диметил-1S-пиридин-2-илкарбамоил)пропил]-N4-гидрокси-2R-изобутил-3S-метоксисукцинамид

Стадия А. Диметиловый эфир 2S-гидрокси-3R-изобутилсукциновой кислоты.

2R-(2,2-Диметил-5-оксо[1,3] диоксолан-4S-ил)-4-метилпентановую кислоту (75.0 г, 0.326 ммоль) растворяют в метаноле (500 мл) и охлаждают до 0oС и полученный раствор насыщают газообразным хлористым водородом. Реакционную смесь доводят до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Растворитель удаляют при пониженном давлении, остаток растворяют в хлористом метилене и промывают последовательно насыщенным раствором бикарбоната натрия и рассолом. Органическую фазу сушат над безводным сульфатом магния, отфильтровывают и упаривают досуха при пониженном давлении с получением вышеназванного соединения в виде желтого масла (53 г, 75%).

1Н-ЯМР, δ (СDС13): 4.10 (1Н, д, J=4.0 Гц), 3.60 (3Н, с), 3.50 (3Н, с), 3.18 (ш.с.), 2.78 (1Н, м), 1.61-1.40 (2Н, м), 1.28 (1Н, м) и 0.76-0.73 (6Н, м).

Стадия В. Диметиловый эфир 2R-изобутил-3S-метоксисукциновой кислоты.

Диметиловый эфир 2S-гидрокси-3R-изобутилсукциновой кислоты (23.9 г, 110 ммоль) растворяют в ДМФА (200 мл) и добавляют перегнанный иодистый метил (8.2 мл, 132 ммоль), а затем окись серебра (I) (27.95 г, 121 ммоль). Реакционную массу перемешивают в течение 7 дней при комнатной температуре в темноте. Растворитель удаляют при пониженном давлении и остаток очищают с помощью колоночной хроматографии (силикагель, хлористый метилен в качестве растворителя) с получением вышеназванного соединения в виде вязкого желтого масла (19.16 г, 75%).

1Н-ЯМР, δ (CDCl3): 3.83 (1Н, д, J=7.5 Гц), 3.71 (3Н, с), 3.62 (3Н, с), 3.30 (3Н, с), 2.85 (1Н, м), 1.65-1.39 (2Н, м), 1.10 (1Н, м) и 0.83-0.81(6Н, м).

Стадия С. Дилитиевая соль 2R-изобутил-3S-метоксисукциновой кислоты.

Гидроксид лития (1.76 г, 42.0 ммоль) добавляют к раствору диметилового эфира 2R-изобутил-3S-метоксисукциновой кислоты (4.70 г, 20.0 ммоль) в метаноле (30 мл) и воде (30 мл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 часов, затем удаляют растворитель при пониженном давлении с получением вышеназванного соединения в виде твердого вещества желтого цвета (4.40 г, количественный выход).

1Н-ЯМР, δ (СD3ОD): 3.52 (1Н, д, J=5.1 Гц), 3.27 (3Н, с), 2.65 (1Н, м), 1.56-1.53 (2Н, м), 1.31 (1Н, м) и 0.82-0.78 (6Н, м).

Стадия D. 4-Метиловый эфир 2R-изобутил-3S-метоксисукциновой кислоты.

Дилитиевую соль 2R-изобутил-3S-метоксисукциновой кислоты (25.14 г, 116 ммоль) растворяют в сухом ТГФ (150 мл) и охлаждают раствор до 0oС. Добавляют трифторуксусный ангидрид (30 мл) и смесь перемешивают при 0oС дополнительно 4 часа. Растворитель удаляют при пониженном давлении, остаток растворяют в безводном метаноле (200 мл) при 0oС и раствор перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Растворитель удаляют при пониженном давлении с получением вышеназванного соединения в виде желтого масла (54.3 г, включая 2 эквивалента литиевой соли трифторуксусной кислоты), которое используют в стадии Е без дополнительной очистки.

1Н-ЯМР, δ (CD3OD): 7.71 (1H, д, J=7.5 Гц), 3.65 (3Н, с), 3.24 (3Н, с), 2.72 (1H, м), 1.56-1.42 (2Н, м), 1.06 (1H, м) и 0.81-0.79 (6Н, м).

Стадия Е. Метиловый эфир 3R-[2,2-диметил-1S-(пиридилкарбамоил)пропилкарбамоил]-2S-метокси-5-метилгексановой кислоты.

Продукт из стадии D (25.06 г, эквивалентны 53,7 ммоль 4-метилового эфира 2R-изобутил-3S-метоксисукциновой кислоты) растворяют в ДМФА (200 мл) и раствор охлаждают до 0oС, добавляя HOBt (8.70 г, 53.7 ммоль) и затем EDC (12.35 г, 64.4 ммоль). Смесь перемешивают и спустя 2 часа доводят до комнатной температуры. Раствор активного эфира, полученный таким образом, охлаждают до 0oС, добавляют L-трет-лейцин-N-(2-пиридил)амид (11.11 г, 53.7 ммоль) и смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Растворитель удаляют при пониженном давлении, остаток растворяют в этилацетате. Промывают раствор последовательно 1М раствором карбоната натрия и рассолом, сушат над безводным сульфатом магния, фильтруют и упаривают досуха. Остаток очищают с помощью колоночной хроматографии (силикагель, от 0 до 5% метанола в хлористом метилене) с получением вышеназванного соединения в виде белого твердого вещества (13.41 г, 61%).

1Н-ЯМР, δ (CDCl3): 9.61 (1H, с), 8.24 (1H, д, J=8.4 Гц), 7.74 (1H, м), 7.07 (1H, м), 6.97 (1H, д, J=8.9 Гц), 4.64 (1H, д, J=8.9 Гц), 4.01 (1H, д, J=7.6 Гц), 3.76 (3Н, с), 3.41 (3Н, с), 2.75 (1H, м), 1.79 (1H, м), 1.51 (1Н, м), 1.11(1Н, м), 1.02 (9Н, с), 0.84 (3Н, д, J=6.3Гц) и 0.82 (3Н, д, J=6.3 Гц).

Стадия F. Литиевая соль 3R-[2,2-диметил-1S-(пиридин-2-илкарбамоил)пропилкарбамоил]-2S-метокси-5-метилгексановой кислоты.

Метиловый эфир 3R-[2,2-диметил-1S-(пиридилкарбамоил)пропилкарбамоил]-2S-метокси-5-метилгексановой кислоты (13.4 г, 32.9 ммоль) растворяют в ТГФ (265 мл) и воде (65 мл) и добавляют моногидрат гидроксида лития (1.396 г, 33.3 ммоль). Раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 2 часов, затем упариванием при пониженном давлении и получают желтое масло, которое сушат при помощи азеотропной отгонки с толуолом. Продукт (13.4 г, содержащий остатки растворителя) немедленно используют без дополнительной очистки.

1Н-ЯМР, δ (CD3OD, смесь диастереомеров 3.5:1): 8.31 (1Н, м), 7.99 (1H, д, J=8.3 Гц), 7.66 (1H, м), 7.00 (1Н, м), 4.49 (0.23Н, с; минорный диастереомер), 4.37 (0.77Н, с; основной диастереомер), 3.68 (0.23Н, д, J=6.7 Гц; минорный диастереомер), 3.52 (0.77Н, д, J=6.7 Гц; основной диастереомер), 3.21 (0.69Н, с; минорный диастереомер), 3.20 (2.31Н, с; основной диастереомер), 2.64 (1H, м), 1.53 (2Н, ш.с.), 1.18 (1H, м), 1.01 (9Н, с), 0.85 (3Н, д, J= 6.4 Гц) и 0.81 (3Н, д, J=6.3 Гц).

Стадия G. N4-Бензилокси-N1-[2,2-диметил-1S-пиридин-2-илкарбамоил]пропил-2R-изобутил-3S-метоксисукцинамид.

Продукт cтадии F (13.4 г, 33 ммоль) растворяют в сухом ДМФА (250 мл), помещают в атмосферу аргона и охлаждают до -10oС с перемешиванием. Добавляют по каплям этилхлорформиат (3.47 г, 36 ммоль), затем NMM (1.8 мл, 16.5 ммоль). Смесь перемешивают в течение 30 минут и затем по каплям добавляют O-бензилгидроксиламин (6 г, 49 ммоль) в ДМФА (10 мл). Реакционную смесь доводят до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Растворитель удаляют при пониженном давлении, а остаток распределяют между этилацетатом и рассолом. Органический слой промывают 1М раствором карбоната натрия, сушат над сульфатом магния, фильтруют и упаривают. Остаток очищают флеш-хроматографией (силикагель, 5% метанола в хлористом метилене). Фракции, содержащие нужный продукт, собирают и упаривают. Продукт насыщают диэтиловым эфиром, чтобы удалить слабо окрашенные примеси. Выход: 9.44 г (58%, смесь диастереомеров >10:1).

1Н-ЯМР, δ (СDС13, основной диастереомер): 10.26 (1Н, с), 9.93 (1Н, с), 8.32 (1Н, м), 8.23 (1Н, д, J=8.2 Гц), 7.63 (1Н, м), 7.25 (5Н, м), 7.12 (1Н, д, J=9.2 Гц), 7.02 (1Н, м), 4.94 (1Н, д, J=10.8 Гц), 4.76 (2Н, д, J=3.8 Гц), 3.88 (1Н, д, J=5.5 Гц), 3.32 (3Н, с), 2.91 (1Н, м), 1.72 (1Н, м), 1.55 (1Н, м), 1.35 (1Н, м), 1.02 (9Н, с), 0.89 (3Н, д, J=6.5 Гц) и 0.85 (3Н, д, J=6.5 Гц).

Стадия Н. N1-[2,2-Диметил-1S-(пиридин-2-илкарбамоил)пропил]-N4гидрокси-2R-изобутил-3S-метоксисукцинамид.

N4-Бензилокси-N1-[2,2-диметил-1S-(пиридин-2-илкарбамоил)пропил]-2R-изобутил-3S-метоксисукцинамид растворяют в смеси метанола (75 мл) и этанола (75 мл) и помещают в атмосферу аргона. Добавляют 10%-ный палладий на угле и через раствор пропускают водород в течение 2 часов, после чего ТСХ-анализ показывает, что весь исходный продукт прореагировал. Систему продувают аргоном и катализатор удаляют фильтрованием. Растворитель удаляют при пониженном давлении с получением вышеназванного соединения в виде белого твердого вещества (8.8 г, количественный выход; смесь диастереомеров 12:1). Т. пл. 163-164oС.

1Н-ЯМР, δ ((CD3)2SO): 10.67 (1H, с), 10.13 (1H, с), 8.90 (1H, с), 8.15 (1H, м), 7.89 (1H, д, J=8.4 Гц), 7.81 (1H, д, J=8.8 Гц), 7.60 (1H, м), 6.93 (1H, м), 4.53 (0.12Н, д, J=9.4 Гц), 4.43 (0.88Н, д, J=8.8 Гц), 3.74 (0.12Н, д, J= 10.0 Гц), 3.32 (0.88Н, д, J=9.8 Гц), 2.98 (0,3Н, с), 2.96 (2.64Н, с), 2.78 (1H, м), 1.23 (2Н, м), 0.84 (10Н, с и м), 0.65 (3Н, д, J=6.4 Гц) и 0.56 (3Н, д, J= 6.3 Гц). 13С-ЯМР, δ (СD3OD): 172.6, 170.0, 166.0, 151.5, 147.9, 136.0, 119.5, 113.6, 61.2, 60.6, 56.7, 46.2, 37.0, 34.0, 26.5, 25.2, 23.7 и 21.7. ИК, nмакс (KBr): 3255, 2957, 1700, 1645, 1524, 1467, 1435, 1370, 1301, 1213 и 1152 см-1.

Найдено, %: С 58.40; Н 7.92; N 13,61. С20Н32N4O5•0.2 Н2O. Найдено,%: С 58.29; Н 7.92; N 13.60.

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ПРИМЕР А
Эффективность соединения по изобретению в качестве ингибитора интерстициальной коллагеназы определяют по методу Cawston and Barrett (Anal. Biochem. , 99, 340-345, 1979), в соответствии с которым 1 мМ раствор испытуемого соединения или его разведение термостатируют при 37oС в течение 16 часов с коллагеном и коллагеназой (буферированными 25 мМ Hepes, рН 7.5, содержащей 5 мМ CaCL2, 0.05% Brij 35 и 0.02% NаN3). Коллаген представляет собой ацетилированный 14С коллаген, приготовленный по методу Cawston and Murphy (Methods in Enzvmology, 80, 711, 1981), вводимому в данное описание в качестве ссылки. Образцы центрифугируют для седиментации негидролизованного коллагена и отбирают аликвотную часть надосадочной жидкости для определения числа сцинтилляций (с помощью сцинтилляционного счетчика) как степени (меры) гидролиза. Активность коллагеназы в присутствии 1 мМ испытуемого соединения или его разведения сравнивают с активностью контрольного (образца), без ингибитора, и результат, представленный ниже, дан как концентрация ингибитора, вызывающая 50%-ное ингибирование активности коллагеназы (IС50).

Эффективность соединения по изобретению в качестве ингибитора стромелизина-1 определяют по методике Cawston et al. (Biochem. J., 195, 159-165, 1981), в соответствии с которой 1 мМ раствор испытуемого соединения или его разведение термостатируют при 37oС в течение 16 часов со стромелизином и 14С-ацетилированным казеином (буферированными 25 мМ Hepes, рН 7.5, содержащей 5 мМ СаС2, 0.05% Brij 35 и 0.02% NaN3). Казеин представляет собой ацетилированный 14С-казеин, приготовленный по методу Cawston et al (ibid). Активность стромелизина в присутствии 1 мМ испытуемого соединения или его разведения сравнивают с активностью в контрольном образце, не содержащем ингибитора, и результаты, представленные ниже, выражены как концентрация ингибитора, вызывающая 50%-ное ингибирование активности стромелизина (IC50).

Эффективность соединения по изобретению в качестве ингибитора 72 kDa-желатиназы определяют по методике, основанной на методе Sllers et al., Biochem. J. , 171, 493-496 (1979). kDa-желатиназу, полученную из клеток RPMI-7951, очищают с помощью хроматографии на желатин-агарозном геле. Фермент активируют термостатированием с аминофенилртутьацетатом и примерно 0.05 единиц термостатируют с 50 мкг меченого [14С]-желатина в соответствующем буфере в течение 16 часов при 37oС. В конце термостатирования добавляют 50 мкг бычьего сывороточного альбумина вместе с трихлоруксусной кислотой (конечная концентрация 16%) для прекращения реакции и осаждения нерасщепленного субстрата. Реакционные пробирки помещают в лед на 15 минут перед тем, как центрифугировать в течение 15 минут при 10 000 об/мин для седиментации осаждающегося субстрата. Берут аликвотную часть 200 мкл надосадочной реакционной жидкости и определяют радиактивность с помощью сцинтилляционного счетчика для жидкостей. Действие ингибитора определяют по кривой эффекта дозы. IC50 (концентрация ингибитора, требующаяся для 50%-ного уменьшения активности фермента) определяют, вычерчивая кривую по данным и вычисляя концентрацию ингибитора, требуемую для достижения 50%-ного ингибирования фермента. Для каждого определения IС50 определяют действие ингибитора на активность желатиназы при примерно 8 концентрациях ингибитора. Ингибиторы растворяют и разводят (разбавляют) в ДМСО.

Результаты вышеописанных испытаний соединения по изобретению следующие:
Фермент - IC50(нM)
Коллагеназа - 10
kDa-желатиназа - 70
Стромелизин - 30
БИОЛОГИЧЕСКИЙ ПРИМЕР Б
Измеряют концентрацию соединения по изобретению в крови лабораторных животных во времени после введения испытуемого соединения. Соединение вводят через зонд группе из 6 подопытных самцов крыс (вес 300 г). Образцы крови отбирают венепункцией хвостовой вены через 0.5, 1.0, 2.0, 6.0 и 24 часа после введения. 0.4 мл крови помещают в пробирки на 4.5 мл, содержащие 0.1 мл кислого цитрата декстрозы (ACD) в качестве антикоагулянта. Для экстракции добавляют 3 мл метанола и осаждающаяся кровь гранулируется при центрифугировании (30 мин, 3000 об/мин). Отбирают аликвотную часть 2 мл надосадочной жидкости и концентрируют лиофилизацией. Экстракт снова растворяют в 200 мкл ДМСО и отбирают аликвоту 10 мкл для анализа активности ингибирования коллагеназы. Ингибиторную активность экстрактов определяют, используя метод анализа коллагеназы, описанный выше, в Биологическом Примере А, и концентрацию ингибитора (т. е. лекарственного препарата плюс любых активных метаболитов) получают сравнением со стандартной кривой. Результаты выражаются в виде максимальной концентрации в нг/мл х часы через 0.5-24 часа и в виде AUC в числе IC50 x часы. Результаты приведены в табл.1.

Соединение по изобретению также испытывают, вводя его перорально игрункам и людям-добровольцам, при этом отмечается высокая степень ингибиторной активности в крови испытуемых после такого введения.

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ПРИМЕР В
Действие соединения по изобретению при злокачественных новообразованиях испытано на двух видах подопытных животных, при этом обнаружена его активность.

Модель: меланома у мышей В16
В этом случае испытуемым мышам C57/BL6J вводят подкожно 105 клеток меланомы мыши В16. Опухоль растет в течение 18 дней и вес опухоли вычисляют с помощью микрометра (штангельциркуля) по следующей формуле: вес (мг) - длина (мм) х ширина (мм) ÷ 4. Группа мышей (n=19) получает соединение, вводимое с помощью осмотического мини-насоса, имплантированного подкожно на стороне, противоположной той, где находится В16-опухоль. Насос имплантируют за день до введения (посева) опухолевых клеток, а доза вводимого соединения составляет 360 мкг/день. Контрольная группа (n=17) получает соответствующий объем носителя с помощью такого же имплантированного насоса.

Средний вес контрольной опухоли через 18 дней составляет 1145±97 мг. Вес опухоли у мышей, получавших соединение по изобретению, составляет 774±50 мг. Это снижение веса (32% в случае испытуемого соединения) является значительным (р<0.005). Оценка образцов в конце эксперимента показывает, что уровень плазмы составляет 26.8±3.2 нг/мл в случае испытуемого соединения.

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ПРИМЕР Г
Соединение по изобретению испытывают на его предрасположенность вызывать видимые признаки тендинита у крыс. Способность соединения по изобретению (Соединение А) вызывать тендинит у крыс ("тендинит-эффект") сравнивают с таковой близкого по строению изомера, а именно N1-[2,2-диметил-1S-пиридин-3-илкарбамоил)пропил]N4гидрокси-2R-изобутил-3S-гидроксисукцинамида (Соединение Б).

Берут самцов крыс Льюиса. В каждом эксперименте до 30 крыс взвешивают и произвольно распределяют на группы вне зависимости от веса тела, n=6/группа. В каждом эксперименте одной группе дают соответствующий носитель для сравнения с каждой группой, получающей лекарственное средство.

Соединение А берут в виде мезилата (соль метансульфоновой кислоты), тогда как Соединение Б находится в виде свободного основания. В случае Соединения А @ 15 мг/мл носитель представляет собой: 50% ДМСО, 37% 0.1 М метансульфокислота и 13% стерилизованная вода; и @ 30 мг/мл носитель: 50% ДМСО, 37% 0.2 М метансульфокислота и 13% стерилизованная вода. Для соединения Б @ 15 мг/мл носитель представляет собой 50% ДМСО/вода.

Alzet (торговая марка) осмотические мининасосы (2ML2, 14 дней, 5 мкл/час от Akza Corp., Palo Alto CA 94303) взвешивают пустыми и заполненными, чтобы быть уверенными в правильности заполнения объема. Перед имплантацией заполненные насосы помещают в термостат при 37oС. Всех крыс анестезируют с помощью галотана. После анестезии загривок выбривают и дезинфицируют. На подготовленной стороне делают продольный разрез, примерно 2 см длиной, и с помощью пары кровоостанавливающих щипцов под кожей делают подкожный карман. Мининасосы помещают так, чтобы выходное отверстие насоса было обращено наружу от раны. На разрез накладывают швы и снова дезинфицируют область вокруг раны. Сразу после операции всем крысам дают анестетик (Temgesic-trade mark-Reckitt and Colman), 0.1 мг/кг подкожно в бок. После того, как кончится действие анестетика, животных возвращают в клетки с сухой подстилкой, чтобы гарантировать, что рана остается чистой до заживления. На следующий день после хирургического вмешательства всех крыс помещают назад на стандартную подстилку и размещают по группам из 3, чтобы можно было более четко наблюдать за признаками тендинита.

После имплантации мини-насосов крыс взвешивают и контролируют возможное начало тендинита. Начало и тяжесть тендинита измеряют с помощью наблюдений, основанных на системе оценок (см. ниже). Крыс наблюдают ежедневно в течение 16 дней. Средние оценки >2 считаются значительными. Применяемая система оценок такова:
Положение лежа
Нормальное - 0
Опирается на одну лапу - 1
Не опирается на лапы - 2
При стимуляции движения животные
Двигаются нормально - 0
Неохотно двигаются - 1
Двигаются с умеренным нежеланием - 2
Очень неохотно двигаются - 3
Походка
Нормальная - 0
Избегают пользоваться одной задней лапой - 1
Избегают пользоваться обеими задними лапами - 2
Результаты показывают, что крысы, получающие дозу Соединения А (как 15 мг/мл, так и 30 мг/мл) и только носитель, не проявляют заметных признаков тендинита, тогда как крысы, получающие дозу Соединения Б, проявляют заметные признаки, начиная с 8 дня и далее (средние оценки >2 на 8 день увеличиваются до 6 на 15 и 16 день).

Было подтверждено, что крысы, получающие соединения А и Б в вышеописанных тестах, подвергаются воздействию соединений из мини-насосов на плазму. Отбирают образцы крови на 3 и 10 дни после имплантации мини-насосов после слабой анестезии крыс голотаном из хвостовой вены. Образцы крови (0.5 мл) помещают в пробирки, содержащие 3.0 мл метанола для экстракции свободного и связанного соединения. Концентрацию в крови Соединения А и Соединения Б определяют методом флуорометрии с применением кумарин-пептидного субстрата Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2 (Mca=(7-метоксикумарин-4-ил)ацетил, Dpa= Н-3-(2,4-динитрофенил)-L-2,3-диаминопропил) (см. Knight et al., FEBS Lett., 1992, 296, 263-266). На 16 или 17 день после имплантации эксперимент заканчивают, крыс окончательно усыпляют и берут образцы крови (0.5 мл) сердечной пукцией и определяют концентрацию Соединения А и Соединения Б.

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ПРИМЕР Д
На подопытных животных ГБС (GBS) испытывают действие соединения по изобретению. Экспериментальный аутоиммунный неврит (ЭАН, EAN) представляет собой опосредуемое Т-клетками аутоиммунное расстройство периферической нервной системы. У подопытных животных проявляются многие патологические особенности ГБС (GBS) с симптомами атаксии, слабости и паралича. EAN можно вызвать у животных, вводя им инъекцию миелина периферических нервов или белковых компонентов миелина, например протеин 0, в адъюванте. EAN-повреждения происходят в спинальных корешках и периферических нервах и характеризуются инфильтрацией периваскулярных мононуклеарных клеток, демиелинизацией аксонов и нарушением нервной проводимости. В патологии GBS и EAN участвует TNFa; уровни TNFa в крови у больных GBS поднимаются и антитела к TNFa уменьшают тяжесть заболевания при EAN (Hartung HP. Annals of Neurology, 1993, 33, 563-567).

Соединение по изобретению испытывают на крысах с EAN, симптомы заболевания вызваны инъекцией миелина периферических нервов в адъюванте. Соединение вводится с помощью имплантированных хирургическим путем мини-насосов с концентрацией 15 или 30 мг/мл со скоростью 5 мкл/час (см. Биологический пример Г), доставка соответственно 7 и 14 мг/кг в день. Терапия соединением в течение всего эксперимента, начиная с 1 до 15 дня, значительно ослабляет проявление клинических симптомов в зависимости от дозы. Соединение также ослабляет, в зависимости от дозы, клинические симптомы в случае EAN-модели при терапевтическом введении с 8 по 15 день при концентрации 15 или 30 мг/мл со скоростью 10 мкл/час и доставке 14 и 28 мг/кг в день соответственно.

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ПРИМЕР Е
Активность соединения по изобретению в случае экспериментальной модели PC (МС).

Метод.

Применяется Модель PC с гиперчувствительностью замедленного типа, описанная Matyszak and Perry (Matyszak M.K. and Perry V.H., 1995. Demyelination in the central nervous system following a delayed type hypersensitivity response to bacillus Calmette-Guerin. Neuroscience 64, 967-977). Анестезируют самцов крыс Льюиса, вводя инъекции 1 мкл физиологического раствора с фосфатньм буфером, содержащего 105 убитых термически бацилл Calmette Guerin (BCG) в полосатое тело левого полушария. BCG вводят стереотаксически с помощью шприца 27G на 10 мкл. Координаты для инъекции: брегма +1.2 мм, латерально (в бок)+3.0 мм и глубина 4.5 мм. Через 4 недели вводят внутрикожно (интрадермально) в заднюю лапу 200 мкл раствора, содержащего 107 термически убитых BCG-организмов в полном адъюванте Фрейнда. Еще через 15 дней крысам вводят внутривенно инъекцию 2750 Ед. пероксидазы хрена тип II (HRP). Через 30 минут крыс более глубоко анестезируют с помощью пентобарбитала натрия и осуществляют транскардиально перфузию 100 мл 0.9% (вес/объем) NaCI, содержащего 5000 Ед. /л гепарина, а затем 200 мл параформальдегид-лизин-периодатного фиксатора (PLP), содержащего 2% параформальдегида и 0.05% глутаральдегида. Мозг удаляют, вторично фиксируют еще в течение 4 часов в PLP и подвергают криозащите, погрузив в 30% раствор сахарозы на ночь при 4oС перед тем, как поместить в Tissue-Tek О.С.Т. (miles inc Elkhart USA) и заморозить в жидком азоте. Для HRP-локализации по методу Hanker-Yates (Perry V.H. et al. , 1992) делают подвижные венечные срезы толщиной 50 мкм. Эта процедура вызывает гиперчувствительность замедленного типа в месте стереотаксической инъекции BCG, характеризующуюся локальным нарушением гематоэнцефалического барьера, на что указывает окрашивание за счет внесосудистого присутствия HRP; инфильтрацией лимфоцитов, на что указывает окрашивание антителами ОХ-22, специфическими к высокомолекулярным формам общих лейкоцитарных антигенов; активацией лейкоцитов, на что указывает окрашивание антителами ОХ-6, специфическими к МНС-антигенам и расщеплением миелина, на что указывает окрашивание с помощью антител к основному миелиновому белку. Все эти особенности являются признаками активных патологических изменений или бляшек, наблюдаемых в центральной нервной системе больных PC (MS). Число лимфоцитов определяют, подсчитывая количество ОХ-22-позитивных клеток на участке, где окрашивание наиболее интенсивно. Число клеток на единичном участке в поле зрения записывают и выражают как клетки/мм2. Области экспрессии МНС класс II, утечки через гематоэнцефалический барьер и демиелинизации рассчитывают, применяя автоматизированный (компьютерный) визуальный анализ и выходные данные в мм2.

Действие соединения по изобретению оценивают, давая его крысам перорально 30 мг/кг дважды в день, начиная с 5 дня после второй инъекции BCG и продолжая давать до 15 дня. Соединение по изобретению дают в физиологическом растворе с фосфатньм буфером в качестве носителя, содержащем 0.01% Tween 80. Контрольным животным дают только носитель.

Области утечки через гематоэнцефалический барьер, экспрессии МНС класс II, демиелинизации и число Т-клеток у животных, принимающих соединение по изобретению, сравнивают с контрольными, получающими носитель, применяя критерий Т Стьюдента.

Результаты. DTH-ответ (замедленная гиперчувствительность) у животных, получавших носитель, характеризуется разрушением гематоэнцефалического барьера, инфильтрацией лимфоцитов, экспрессией МНС класс II и демиелинизацией. У животных, получавших соединение по изобретению, наблюдается заметное снижение площади утечки через гематоэнцефалический барьер (р<0.05) и показателя инфильтрации Т-клеток (р<0.0001). Уменьшение демиелинизации и экспрессии МНС класс II наблюдается, но не достигают статистически значимой величины.

Действие соединения по изобретению на DTH-модели PC см. в табл.2.

Похожие патенты RU2198164C2

название год авторы номер документа
ЦИТОСТАТИЧЕСКИЕ АГЕНТЫ 1998
  • Пирсон Линдсей Энн
  • Эйскоу Эндрю Пол
  • Хакслей Филип
  • Драммонд Элан Хастингс
RU2187499C2
ПРОИЗВОДНЫЕ ГИДРОКСАМОВОЙ ИЛИ КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ИЛИ ВЕТЕРИНАРНАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ИХ ОСНОВЕ 1995
  • Беккет Раймонд Поль
  • Уиттакер Марк
  • Миллер Эндрю
  • Мартин Фиона Митчелл
RU2136657C1
АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ АГЕНТЫ 2000
  • Прэтт Лиза Мэри
  • Киавей Кеннет Ноэл
  • Пэйн Гилс Денис
  • Мунье Лоран Франк
RU2269525C2
АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ АГЕНТЫ 1999
  • Хантер Майкл Джорж
  • Бекетт Раймонд Пол
  • Клементс Джон Мартин
  • Уиттакер Марк
  • Дэвис Стивен Джон
  • Прэтт Лайза Мари
  • Спэволд Зое Мари
  • Лоунчбари Стивен
RU2246941C2
ПРОИЗВОДНЫЕ ГИДРОКСАМОВОЙ КИСЛОТЫ, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ИЛИ ВЕТЕРИНАРНАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ИХ ОСНОВЕ 1993
  • Диккенс Джонатон Филип
  • Криммин Майкл Джон
  • Беккетт Раймонд Пол
RU2126791C1
ПИРРОЛОПИРИДАЗИНОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ 2001
  • Ивабути Харуо
  • Хагихара Масахико
  • Сибакава Нобухико
  • Мацунобу Кейдзи
  • Фудзивара Хироси
RU2254335C2
ИЗОСЕРИНОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ IXA 2007
  • Штайнхаген Хеннинг
  • Фолльманн Маркус
  • Герлитцер Йохен
  • Шройдер Херман
RU2446157C2
ПРОИЗВОДНЫЕ ЭТИЛЕНДИАМИНА И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ ИНГИБИТОР FXa И АНТИКОАГУЛЯНТ 2001
  • Йосино Тосихару
  • Нагата Цутому
  • Хагиноя Нориясу
  • Йосикава Кендзи
  • Канно Хидеюки
  • Нагамоти Масатоси
RU2268259C2
СОЕДИНЕНИЯ, ПРИГОДНЫЕ ДЛЯ ТЕРАПИИ ПРОТИВ ВИЧ 2019
  • Дэ Ла Роса Марта Алисиа
  • Данхэм Ричард М
  • Марголис Дэвид
  • Таи Винсент Уинг-Фаи
  • Танг Джун
RU2806030C2
МОДУЛЯТОРЫ ПРОТЕОЛИЗА И СООТВЕТСТВУЮЩИЕ СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ 2019
  • Крю, Эндрю, П.
  • Хорнбергер, Кейт, Р.
  • Ван, Цзин
  • Дун, Ханьцин
  • Берлин, Михаэль
  • Крюс, Крэйг М.
RU2805511C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 198 164 C2

Реферат патента 2003 года N-[2,2-ДИМЕТИЛ-1S-(ПИРИДИН-2-ИЛКАРБАМОИЛ)ПРОПИЛ]-N-ГИДРОК СИ-2R-ИЗОБУТИЛ-3S-МЕТОКСИСУКЦИНАМИД ИЛИ ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ПРИЕМЛЕМАЯ СОЛЬ, ГИДРАТ ИЛИ СОЛЬВАТ

Изобретение относится к новому N1-[2,2-диметил-1S-(пиридин-2-илкapбaмoил)пропил] -N4-гидpoкcи-2R-изoбyтил-3S-метоксисукцинамиду или его фармацевтически приемлемым солям, гидратам или сольватам. Указанные соединения обладают биологической активностью и могут быть использованы в медицине для лечения ревматоидного артрита, злокачественных новообразований, рассеянного склероза или псориаза. 2 табл.

Формула изобретения RU 2 198 164 C2

N1-[2,2-Диметил-1S-(пиридин-2-илкарбамоил)пропил]-N4-гидрокси-2R-изобутил-3S-метоксисукцинамид формулы (II)

или его фармацевтически приемлемая соль, гидрат или сольват.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2003 года RU2198164C2

Бесколесный шариковый ход для железнодорожных вагонов 1917
  • Латышев И.И.
SU97A1
Прибор для очистки паром от сажи дымогарных трубок в паровозных котлах 1913
  • Евстафьев Ф.Ф.
SU95A1
5-ХЛОР-2-ПИРИДИЛАМИД-4-НИТРО-N-(КАРБОКСИМЕТИЛ)АНТРАНИЛОВОЙ КИСЛОТЫ, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ 1991
  • Левитин Евгений Яковлевич[Ua]
  • Кабачный Владимир Иванович[Ua]
  • Яковлева Лариса Васильевна[Ua]
  • Божкова Надежда Андреевна[Ua]
  • Макаренко Ольга Николаевна[Ua]
RU2024507C1

RU 2 198 164 C2

Авторы

Бекетт Рэймонд Пол

Уиттакер Марк

Миллер Эндрю

Мартин Фионна Митчелл

Даты

2003-02-10Публикация

1997-11-13Подача