Способ иммобилизации клеток микроорганизмов Советский патент 1991 года по МПК C12N11/04 C12N11/08 

Изобретение относится к прикладной микробиологии и биотехнологии, в частности к способам иммобилизации клеток микроорганизмов в частицы полимерного геля, и может быть использовано в пищевой, медицинской и

микробиологической промышленности для трансформации органических соединений и получения продуктов микробного синтеза.

Максимальная сорбитолдегидрогеназ- ная активность Gluconobacter oxydan :

56,3 мМоль/мл гранул в 1 ч при введении трансформации в присутствии 0,1%-ного дрожжевого экстракта операционная стабильность при этом составляет 14 сут.

Гидроксилирующая активность Aspergillus niger 0,49-10 мМоль/мл гранул в 1 ч, стабильность 10 сут.

Цель изобретения - упрощение способа, повышение ферментативной активности иммобилизованных клеток.

Способ основан на гам, что в качестве гелеобразующего раствора используют водный раствор полимера класса N-вини- ламидов с мол.м. 125 -10-1 10 , а гранулы с иммобилизованными клетками получают при добавлении суспензии клеток в геле- образующем растворе к водно-солевому раствору, содержащему в качестве стабилизатора танин, при 29-40°С.

Полученные гранулы промывают физиологическим или буферным раствором от избытка стабилизатора и невключившихся клеток, переносят в среду и используют для трансформации.

В качестве полимера для получения иммобилизованных клеток микроорганизмов используют полимеры из класса N-виниламидов, конкретно поли-М-винил- капролактам (ПВК), а также сополимеры метилакрилата, метилметакрилата, винила- цетата с ПВК и N-виниламидами следующего строения:

Ri - СНз; R2 - СзН ; Ri - C2Hs; Ra - С2НБ; Ri - R2 - СНз.

Данные об использовании каких-либо полимеров класса N-виниламидов для получения иммобилизованных клеток при анализе данной и смежных областей техники не выявлены.

Синтез мономеров N-виниламидов алифатических карбоновых кислот описан, синтез полимеров и сополимеров также.

Способ осуществляют следующим образом.

Готовят стерильные растворы полимеров и стабилизатора дисперсии, клеточную суспензию смешивают с раствором полимера при комнатной температуре. Полученную смесь подают по каплям в подогретый до 29-40°С буферный или физиологический раствор, содержащий 0,5-1,0% танина, при перемешивании. При этом образуются гранулы геля с включенными в них клетками микроорганизмов. Полученные гранулы промывают физиологическим или буферным раствором для удаления избытка танина и невключившихся клеток, переносят в среду и используют для трансформации С целью предотвращения слипания гранул в ходе многократных периодических

трансформаций гранулы по завершении очередной трансформации промывают физиологическим или буферным раствором, содержащим танин в концентрации 0,05%. Все операции проводят (по возможности) в

асептических условиях.

Для осуществления способа иммобилизации используют бактерии Gluconobacter oxydans штамм ВНИВЙ-6, окисляющие D-сорбит в L-сорбозу и грибы Aspergillus

nlger В KM F-212, гидроксилирующие индо- лил-3-уксусную кислоту с получением 4, 5 и 6-оксипроизводных.

Сорбитолдегидрогеназную активность оценивают по скорости накопления сорбозы в культуральной жидкости. Концентрацию сорбозы определяют по методу определения редуцирующих Сахаров и выражают в мМоль/мл гранул в 1 ч.

Гидроксилазную активность оценивают

по скорости накопления продуктов реакции в культуральной жидкости и выражают в процентах концентрации исходного субстрата в единицу времени. Концентрацию продуктов реакции оценивают методом тонкослойной хроматографии.

Операционную стабильность ферментативной активности иммобилизованных клеток оценивают по продолжительности трансформаций, в которых снижение ферментативной активности не превышает 50% от исходной, и выражают в сутках.

Пример 1. 10 мл суспензии клеток Cluconobacteroxydans штамм ВНИВИ-б, содержащей 114 мг клеток (по сухому веществу), выращенных до стадии замедления роста (в течение 16-18 ч) на среде, содержащей сорбит и дрожжевой экстракт, и отмытых от ростовой среды стерильным физиологическим раствором, смешивают с

10 мл гелеобразующего раствора - 5,4%-но- го стерильного водного раствора поли-М-ви- нилкапролактама (ПВК) с мол.м. 900000 (конечная концентрация ПВК 2,7%). Полученную суспензию с помощью шприца по

0 каплям добавляют к 150 мл стерильного физиологического раствора, содержащего 0,5% танина, при 37°С. Образующиеся полимерные гранулы с иммобилизованными клетками промывают физиологическим рас5 твором, переносят в трансформационную среду, содержащую 100 г/л сорбита и 0,1% дрожжевого экстракта (рН 5,5-5,8), и используют для трансформации D- сорбита в L-сорбозу

Процесс трансформации осуществляют в стандартных условиях в колбах Эрленмей- ера объемом 750 мл, содержащих 50 мл трансформационной среды и 20 мл гранул, при перемешивании на качалке со скоростью 220 об/мин и при температуре 30°С. По окончании трансформации (в среднем через 24 ч) гранулы отделяют, промывают физиологическим раствором, содержащим 0,05% танина, и используют для проведения последующих трансформаций.

Максимальная сорбитолдегидрогеназ- ная активность 91 мМоль/мл гранул в 1 ч, операционная стабильность 15 сут.

П р и м е р 2. Способ осуществляют по примеру 1, но в качестве гелеобразующего раствора для получения гранул используют сополимер N-винилкапролактама с N-вини- лацетатом (содержание N-винилацетата 15 мас.%), имеющий молекулярную массу 200000 при концентрации 7,2% (конечная концентрация 3,6%). Полимерные гранулы получают, используя физиологический раствор, содержащий 0,7% танина, при 29°С,

Максимальная сорбитолдегидрогеназ- ная активность 83 мМоль/мл гранул в 1 ч, операционная стабильность 14 сут.

П р и м е р 3. Способ осуществляют по примеру 1, но в качестве гелеобразующего раствора используют 10,8%-ный раствор поли-М-винилкапролактама с мол.м. 1 10 .

Максимальная сорбитолдегидрогеназ- ная активность 96 мМоль/мл гранул в 1 ч, операционная стабильность 15 сут.

П р и м е р 4. Способ осуществляют по примеру 1, но в качестве гелеобразующего раствора используют 7,2%-ный водный раствор сополимера М-этил-М-винилами- да масляной кислоты с метилметакрилатом (содержание метилметакрилата 10 мас.%), имеющего мол.м. 350000. Полимерные гранулы получают, используя физиологический раствор, содержащий 1% танина, подогретый до 40°С.

Максимальная сорбитолдегидрогеназ- ная активность 66 мМоль/мл гранул в 1 ч, стабильность 14 сут.

П р и м е р 5. Способ осуществляют по примеру 1, но берут 10,8%-ный раствор сополимера N-метил-М-виниламида масляной кислоты с метилметакрилатом (содержание метилметакрилата 15 мас.%) с мол.м. 250000. Полимерные гранулы получают, используя 0,01 М фосфатный буфер (рН 5,5), содержащий 0,7% танина, при 38°С.

Максимальная сорбитолдегидрогеназ- ная активность 74 мМоль/мл гранул в 1 ч, операционная стабильность 14 сут.

Примерб. Способ осуществляют по примеру 1, но берут 10,8%-ный раствор сополимера N-этил-М-виниламида пропионо- вой кислоты с метилакрилатом (содержание 5 метилакрилата 13 мас.%) с мол.м. 300000. Гранулы получают, используя физиологический раствор, подогретый до 39°С.

Максимальная сорбитолдегидрогеназ- ная активность 68 мМоль/мл гранул в 1 ч, 0 операционная стабильность 15 сут.

Пример. Способ осуществляют по примеру 1, ноиспользуют5,4%-ный раствор сополимера N-винилкапролактама с метилметакрилатом (содержание метилметакри5 лата 10 мас.%) с мол.м. 300000. Гранулы получают, добавляя по каплям полученную суспензию клеток в физиологический раствор, содержащий 0,7% танина, подогретый до 30°С.

0 Максимальная сорбитолдегидрогеназ- ная активность 89 мМоль/мл гранул в 1 ч, операционная стабильность 15 сут.

ПримерЗ. Способ осуществляют по примеру 1, но гранулы получают при добав5 лении гелеобразующего раствора с клетками в 0,01 М фосфатный буфер (рН 5,8), содержащий 0,5% танина, при температуре 40°С.

Сорбитолдегидрогеназная максималь0 пая активность 94 мМоль/мл гранул в 1 ч, операционная стабильность 15 сут.

В табл,1 приведены результаты иммобилизации клеток Gluconobacter oxydans ВНИВИ-6.

5 П р и м е р 9. Культуру Asperglllus nlger ВКМ F-212 поддерживают на скошенном сусло-агаре. Для получения споровой суспензии делают смыв с косяка 5 мл стерильной водопроводной воды (1 мл суспензии

0 содержит 31,5-106 спор).

5 мл споровой суспензии смешивают с 5 мл гелеобразующего раствора- 10,8%-но- го водного раствора ПВК с мол.м. 9-105. Полученную суспензию с помощью шприца

5 по каплям добавляют к 75 мл 0,01 М фосфатного буфера (рН 5,5), содержащего 0,5% танина, при 37°С и слабом перемешивании. Полученные гранулы выдерживают в этом растворе без перемешивания еще в течение

0 40 мин. Затем гранулы промывают стерильным физиологическим раствором, переносят в коническую колбу Эрленмейера объемом 750 мл, содержащую 100 мл сусла 7° Г, и перемешивают на качалке со скоро5 стью 200 об/мин при 28°С в течение 24 ч. За это время из включенных в гель спор развивается мицелий. Таким образом, полученный иимобилизованный мицелий (16 мг/мл геля) отделяют от ростовой среды многократной декантацией в асептических условиях, промывают стерильным физиологическим раствором и используют для трансформации. Последнюю проводят в конических колбах Эрленмейера объемом 750 мл 0,01 М фосфатного буфера (рН 5,5), куда помещают 20 мл гранул и 1,0 мл эта- нольного раствора индолил-3-уксусной кислоты (ИУК), содержащего 50 мг ИУК. Колбы помещают на качалку (220 об/мин при 28°С). Контроль за ходом трансформации осуществляют методом качественной и количественной тонкослойной хроматографии на пластинках Silufol UV-254.

В описанных условиях гидроксилирова- ние полностью проходит за 12-15 ч трансформации с образованием 55-60% 5-ОН-ИУК и 40-45% 4-ОН-ИУК. После проведения транформации гранулы, отделенные от трансформационной среды, промывают стерильным физиологическим раствором и используют для последующих трансформаций. Возможно проведение восьми последовательных трансформаций без снижения активности. Гидроксилиру- ющая активность иммобилизованной системы сохраняется в течение 30 сут, что свидетельствует о стабилизации гидрокси- лирующей активности в процессе иммобилизации.

В табл.2 представлены сравнительные данные по гидроксилирующей активности и стабильности, полученные по предлагаемому и известному способам (результаты иммобилизации клеток Aspergillus niger В KM F-212).

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить ферментативную активность (сорбитолдегидрогеназную - в 1,2-1,6 раза, гидроксилирующую - в 1,6

раза) при сохранении ее операционной стабильности (14-15 сут - для сорбитолде- гидрогеназной активности, 5 сут - для гидроксилирующей активности).

Формула изобретения

1, Способ иммобилизации клеток микроорганизмов, предусматривающий смеши- вание суспензии клеток с водным раствором полимера и гранулообразование, отличающийся тем, что, с целью

упрощения способа, повышения ферментативной активности иммобилизованных клеток, используют водный раствор полимера из класса N-виниламидов с мол.м. 125000- 1000000 и концентрацией, обеспечивающей

2,7-5,4%-ное содержание его в смеси с суспензией клеток, а гранулообразование осуществляют добавлением по каплям полученной смеси в водно-солевой раствор, содержащий в качестве стабилизатора

0,5-1,0% танина, при 29-40°С.

2. Способ по п.1,отличающийся тем, что в качестве водного раствора полимера из класса N-виниламидов используют водный раствор поли-М-винилкапролактама

или сополимера N-винилкапролактама с N- винилацетатом, или сополимера Ы-этил-Ы- виниламида масляной или пропионовой кислоты с метилметакрилатом, или сополимера N-винилкапролактама с метилметакрилатом.

Таблица 1

Изобретение относится к прикладной микробиологии и биотехнологии, в частности к способам иммобилизации клеток микроорганизмов в частицы полимерного геля. Цель изобретения - упрощение способа повышения ферментативной активности иммобилизованных клеток. В качестве гелеобразующего раствора используют водный раствор полимера класса N-винилами- дов, а гранулы с иммобилизованными клетками получают при добавлении суспензии клеток в этом растворе к водно-солевому раствору, содержащему в качестве стабилизатора полимерной дисперсии танин, при температуре 29-40°С. Способ иммобилизации позволяет повысить ферментативную активность клеток (сорбитол- дегидрогеназную - в 1,2-1,6 раза, гидроксилирующую - в 1,6 раза) при сохранении ее операционной стабильности. 1 з.п. ф-лы, 2 табл. Ё Qs 00 XI С СП

Примечание. Средняя продолжительность одной трансформации 22-24 ч.

Таблица 2