Штамм @ ИБ-продуцент протеолитических ферментов Советский патент 1983 года по МПК C12N15/00 C12N9/50 

ОС

1С

Изобретение относится к ферментной промьпиленности, в частности к получению нового штамма - продуцента протеолитических ферментов (протеинаэы и эластазы).

Протеиназы и эластаза, образуемые 5 вьщеленным штаммом, могут быть с успехом использованы в медицине, в частности для приготовления белковых гидролизатов, предназначенных для парентерального белкового питания 10 больных, для очищения ожогов, ран от некротических тканей, в легкой промышленности для Ъбезволошивания кожевенного сырбя и растворения дермы меховых отходов, в пищевой промыш- 15 ленности для улучшения качества и мягчения мяса.

Известны продуценты протеолитических ферментов - отдельные представители Actinomyces; Actinomyces ав- 20 bus, Act. rinogus. При культивировании этих микроорганизмов получают ферментные препараты, обладающие протеолитической, незначительной трипсиновой, эластолитической и ами- -с лолитической активностью Cl3 и C2J.

Наиболее близким является штагдал Act. fradiae 119 - продуцент протеиназы и эластазы С31.

Недостатком данного штамма явля- ется сравнительно низкий уровень О биосинтеза эластазы (Фермент, растворяющий эластин - основной белковый компонент эластичных волокон, встречающихся преимущественно в органах, обладающих большой эластич- 35 ностью: выйная связка, азота, легкие) ....

Цель изобретения - получение штамма - более активного продуцента , Протеиназы и особенно эластазы. 40,

Новый штамм .Actinomyces fradiae ИБ выделен из почв.восточной Грузии. Изучена его спонтанная изменчивость, в результате чего отобран наиболее активный по биосинтезу протеолити- 45 ческих ферментов культурально-морфологический вариант (вариант 1Г1), который имеет активность Протеиназы ед/мл, эластазы 35 ед/мл. Штамм хранится в музее коллекций культур Института биохимии растений АН Грузинской ССР.

Морфологические признаки. Морфология .штамма Actinomyces fradiae ИБ зучена как путем прижизненного микоскопирования культур, выращенных 55 а разных питательных средах, так и лектронным микроскопированием кульуры. . .

Для выращивания применяются слеующие питательные среды.60

Среда СР-1 с глюкозой г/л: KNO, 1; НлР04 0,5; MgSO 0,5Г NaCP 0,5; аСС 1; . агар-агар 20,0.

Среда СР-1 с крахмалом, г/л: lilOjJ; К2НР04 0,5; MgSO 0,5; 65

Nace 0,5; саСОз 1; FeSO следы; крахмал 20.

.. Среда CP-II, г/л; (NH4)2S04 2,64; ;К,НР04 2,65; МдСе2 KHjPO42,38 ZnS,04 О02; CuSO. 0,01; FeSO- 0,01; MnCE20,08; глюкоза 20; агар 2.0.

Среда III, г/л: (Ш4)2НРО4- KgHPQ2 MgSQ, 0,1; NaCC 9,0; CaCgg Of 4; FeSO4 0,02; ZnSO4 0,01; глюкоза 20; агар 20.

Крахмало-аммиачный агар, г/л: (NH4)2S04.1; К2НРО4 1; MgSO4 1; NaC 1; CaCO 3; крахмал 17,0; агарагар 20,0.

; Мясо-пептонный агар - водяная мясная вытяжка (1000 мл), г/л: пептон 10,0; NaCe 5; агар-агар 20,0.

Картофельный агар - картофельный отвар 2000 мл, агар-агар 20,0.

Мицелий культуры воздушный, спороносцы неспирйльные длинные с крючкообразным завитком на концах. Споры 15-суточной культуры, выращенной на среде СР-1 с глюкозой, в электронном микроскопе при увеличении в 12000 ра в основном овальные, продолговатые с -гладкой оболочкой.

Для изучения культуральных свойст применяется ряд синтетических и органических сред. Культивирование проводят при 28°С. Наблюдение за ростом интенсивностью окраски воздушного мицелия колонии и среды проводят на 5, 10, 15 и 30-е сутки роста. Рост на средах СР-Г с глюкозой очень хороший. Воздушный мицелий розовый с бе|лым оттенком, колонии бесцветные, |среда неокрашена.

Среда I с крахмалом. Рост очень хороший, воздушный мицелий пушистый, розового цвета, колонии розовые, среда неокрашена.

Среда II. Рост очень хороший, воздушный мицелий белый, колонии светло-коричневые, среда бесцветная. Среда III. Рост средний, куЛьтура не образует воздушного мицелия, колонии в среде бесцветные.

Крахмало-аммиачный агар. Рост средний, воздушный мицелий беловаторозовый, колонии в среде неокрашены. Картофельный агар. Рост очень хо;роший, воздушный мицелий пушистый, бархатистый, розовый, колонии серые, :среда бесцветная.

I Мясо-пептонный агар. Рост средний колонии голые, без воздушного мицелия; Цвет колонии среды белый.

Отношение к источникам углерода. Хорошо усваивает глюкозу, галактозу, ксилозу, мальтозу, крахмал. Слабо усваивает арабинозу, рафинозу, сорбит. Не усваивает рамнозу, маннит, сахарозу, лимоннокислый натрий и уксусно у1слый натрий.

Отношение к источникам азота. Хорошо усваивает нитрат, ot-аланин.

-аланин, треонин, аргинин, лизин, глицин, аспарагиновую кислоту. Уме- реино ассимилирует , (N114) НРОц., мочевину, цистин, метионин. Слабо усваивает NH.CB лейцин, валин, фенилаланин, тирозин, триптофан, гуанин,5 аспарагин, изолейцин.

Отношение к источникам фосфора. Усваивает разнообразные фосфорные соединения.

В результате определения антибак- 10 термальной способности выявлено, что культура активно подавляет рост грамположительных и гракютрьцательнь х бактерий, некоторых микобактерий, дрожжей, клубеньковых бактерий, гри- 5 бов и актиномицетов.

На среде, содержащей крахмал в качестве источника углерода, синтезирует протеиназу и эластазу.

.Активность по протеиназе 9,6 ед/мл л по эластазе 35,0 ед/мл. ,

Пример 1. Штамм Actinomyces fradiae ИВ вьщелен из почв восточной Грузии. В результате изучения его

спонтанной изменчивости отобран Нс иболее активный п6 биосинтезу протеолитических ферментов культуральноморфологический вариант (вариант III).

Культивирование штамма провсдяг на среде следующего состава, г/л: Крахмал70,0

Соевая мука17,6

(im)y50.0,9

KHjPO 0,8

CaCOj3,0

,02

Fesqj0,01

MnCCg0,01

при на качалке (160 об/мин) в течение 120 ч.

Посевным материгшом служит 46-часовая культура выращен {ая глубимньм способом на среде следукицего состава, г/л; Крахмал « 20,0 Соевая мука 20,0 (NH4)2SQ,. 3,0 NaC 2,5 КНйРО 0,5 СаСОэ 3,0 при. 30°С на качалке Г60 об/мин).

Параллельно выращиваю ActinoRiy- ces fradiae 119.

Данные лабораторной проверки кул турагьной жидкости на активность ферментов протеолитического комплек полученного штаммд в сравнении с известным штаммом приведены в та5л.1.

Штам4 Actinbroyces firadlae И1Б (коллекция Цеитрального муяея промьтшенньЕк микроорганизмов института ВНИИгенетика, регистрационный номер ЦМПМ8-570) - продуцент протеолитических ферментов..

Actinomyces fradiae ИБ

Actinomyces fradiae 119 (прототип)

Активность протеиназы определяют методом Анс;она в модификации Петровой и Випцюнайте.

Для определения активности эластазы используют метод Вильямса, модифицированный Петровой и Зуевой.

Как видно из табл. 1 полученный штамм Actinomyces fradiae ИБ отличается от Actinorayces fradiae 119 повышенной способностью биосинтеза протеиназы и эластазы.

Установление глубины гидролиза Некоторых белков протеиназами Acti- nomyces fradiae ИБ, а также изучение продуктов протеолйза позволяют оценить возможности использования этих ферментов для приготовления белковых гидролизатов с целью парентерального белкового питания больных.

Результаты исследований показали, что протеиназа и эластазагвыделеннные из комплекса протёолитических фёрмент.ов, действуют на казеин, альбумин, эластин, яичный белок, белки крови и осуществля1(№ глубокий гидролиз этих белков,разрушая от 40 до 85%.

9,6

35,0 4,3 11,3

общего числа пептидных связай с образованием свободных аминокислот и низкомолекулярных пептидов {ди- и трипептидов).

Пример 2. Для проведения протеолйза готовят 2%-ны растворы аль умина, казеина, эластина, яичного белка и белка крови в 0;012М боратном буфере (рН 8,0), добавляют раствор протеаз в отношении (по весу) субстрат: белок препарата 500:1. Протеолиз проводят при 37°С ; в течение 72 ч, через каждые 24 часа в раствор гидролизуемых белков

вносят дополнительно по 1 г фермента. Глубину гидролиза определяют по увеличению количества аминного азота в растворах после протеолйза и зыражают в процентах. За 100% принимают

количество аминного азота, оОразовавшегося после кислотного гидролиза исследуемых белков,

Сравнительная оценка глубины гкдролиза белков препаратами протеаз

представлена в табл. 2. Таким образом, новый шта1«( Acti- х nomycee fradlae ИБ позволяет получать

таблица 2 высокоактивный препарат протеолити ческих ферментов.