Штамм лиа-т-049-продуцент кислой протеиназы Советский патент 1980 года по МПК C12N15/00 C12D13/10 

(54) ШТАММ ACREMONIUM CHRYSOGENUM ЛИА-Т-049 ПРОДУЦЕНТ КИСЛОЙ ПРОТЕИНАЗЫ

, 1 Изобретение относится к медицинской промышленности, в частности к микробиологическому синтезу ферментов . Известен штамм Acremoniutn chryso- gehum - продуцент 1 ислой протеина:зы характеризующийся следукнцими мо1рфоло го-культуральными признаками р.. Штамм образует простые конидиеносцы, прямостоящие, с гладкими стенка ми, бесцветные, 25-50 мкм длиной, 1,5-2,5 мкм в диаметре у основайи ; и 0,6-1,2 мкм у вершины. Конидии в пло;гных слизистых головках эллипсоидные, бесцветные, с несколько уплотненным нижним концом, иногда слабо искривленным, с хрупкими гладкими стенками. Конидий у типового штамма имеют размеры 4,-1-4,3 х . 2-,4-2,6 мкм, иногда до l/e-l/B мкм , шириной. Типичные хламидоспоры ОТсутстэуют. В старых культурах гифы распадаются на фрагменты,-подобные артроспорам. Спороо.бразование чаще весьма скУд ное. Усиление споруляции можно достигнуть, применяя среди со стеблям люпина. Колонии дрожжевидные, слизистые, тонко складчатые, хромб-желгаё или тонко МуШстШТ сухиёТ -ёледно-желтые. На 10-й день колонии достигают .8- 15 мм в диаметре. Обратная сторона колоний и агар окрашены в интенсивный хромово-ж.елтый цвет. Наиболее интенсивный рост набл1эдаётся в кислом вишневом агареi Недостаток штамма - недостаточно высокая активность фермента. Цель изобретения - выявление шт.амма, способного синтезировать кис.пу1б прбтёиназу с молокосвертывающей активностью. . Штамм Асremoniurn chrysogenum ЛИА-Т-049 вьаделен из почвенного образца ( 8520 Ленинг)радской области. Штамм Acremoniutn chrysogenum дродуцент кислой протеиназы. Хранится в коллекции Всесоюзного научно-исследовательского технологического инсти гута антибиотиков и ферментов медицинского назначения под номером ЛИА-Т-049. Морфологические признаки. Культура Acremonium chrysogenum ЛИА-Т-р49 .образует неразветвлеиные несептированные конидиеносцы, в виде боковых прямостоящих веточек о 30-90x2,0 мкм. Конидии эллипсоидные, одноклеточные, бесцветные, 3-4,5 х 1,5 мкм.

собраны в плотных елизистых головках ириной 4,5-9 мкм, длиной 6 мкм. ТийЧныё хламидоспоры отсутствуют. Гифы тонкиё, слабб септирбванныё, ветвящиеся, 1,5 мкм толщиной. В старыхкультурах гифы распадаются на фрагменты, подобные артроспорам.

Спорообразование чаще скудное. Культуральные признаки. Агар ЧЗпека с глюкозой. Колонии светло-бежевые, на 8-й день достигают б мм в диаметре, складчатые, сухие. .Воздушный №целий беловатый, пушистый. Раство-V pntfliifi пигмент отсутствует. Суслоагар. Колонии бледно-желтые, сухие, складчатые, достигают 10-12 мм в. диаметре на 8-10-й день. Воздушный лшцелий белый, пушистый. Растворимый пигмент отсутствует. Среда не окрашена. Картофельный агар. Колонии светло-бежевые, сухие, тонко-складчатые, 9-10 мм в диаметре, с пышным, белесым мицелием. Растворимый пигмент отсутствует. не окрашен.

Кукурузный агар. Колонии желтоватые, сухие. На 8-10-и день колонии достигают 12-14 мм в диаметре. Воздушный мице.лий беловатый, пушис ты Й. Среда не окрашена. -

Органическая среда с переваром Хоттингера. Колонии светло-бежевые, 6-8 мм в диаметре. Воздушный мицелий беловатый, слегка пушистый. Растворимый пигмент Отсутствует. Крахмало-аммиачный агар. Колонии светло-бежевые, сухие, складчатые до б мм в диаметре на 8-й день рост. Воздушный мицелий белесый, пушистый. Растворимый пигмент отеутствует. , Г .

Физиолого-биохимические признаки. Усваивает как органический,так и не органический азот. Оптимальная температура роста 23-25с. Развитие культуры лучше при рН 6,06,5. В качестве единственных источников углерода и энергии используют глюкозу, сахарозу, крахмал, арабинозу, ксилозу, мальтозу, маннйт, инозит, не усваивает фруктозу, рамнозу, галактозу. -Хорошо разжижает желатину, молоко, коагулирует и пептонизирует, крахмал .гидролизует, растет на клетчатке. Антимикробных сврйств штамм не проявляет.

.Культура, хранится на агаре Чапека или в лиофильно высушенном виде.

При глубинной ферментации штамм Acremonium chrysogenum ЛИА-Т-049 йЬ1дёлае ку №турайьную я идкбсть кислую прртеиназу молокосвертнвающего действия.Биосинтез кислой проТеиНазы проводили на качалке

(220 об/мин) при температуре 23-24 С в течение 5 сут. в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл со 100 мл среды следующего состава, вес.%: кукурузный экстракт 0,1 (по общему

азоту); соевая мука 2,0/ сернокислый аммоний 0,2, глюкоза 2,OJ крахмал 2; мел 0,3; рН до стерилизации 6,7-6,8.

По окончании ферментации протеолитическая- активность культуральной жидкости при рН 4,0-5,0 составляла 2,0-1,2 ПЕ/мл. Молокосвертывающая актг рность культуральной жидкости 200-300 ЕД/мл. Время створаживания молока 1,5-2,0 мин.

Для выделения кислой протеиназы культуральную жидкость центриф гировли при 3000 об/мин в течение ЗО мин при 10-12°С.

Осадок отбрасывали,к нативному раствору добавляли сульфат аммония (0,6% насыщения) при 4., жидкость оставляли в холодной камере на 18 ч. Затем осадок отделяли и растворяли в дистиллированной воде. Полученный раствор концентрировали с помощью ультрафильтрационной установки, затем подвёрзгали диафильтрации и лиофильной сушке.:.. :

Изучение препарата кислой протеиназы показало, что он обладает протеолитическбй активностью в кислой области рН 4-5 (О,.6-0,7 ПЕ/мг), а при совместном инкубировании с пепЭином потенцирует протёолитическу активность последнего..

Пример. Проведено испытание штаМма Acremonium chrysogenum . ЛИА-Т-049 при глубинной ферментации в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл на качалках ( об/мин) при температуре 23-24с. Для хранения культуры й Приготовления посевных партий была использована агаризованнай; среда следующего состава, %; глюкоза 2,0, K2HPO O,l,NaNO.a 0,3, КСЕ 0,05, МдЗСд 0,05, РеЗОд 0,0015, агар-агар 2,0, рН до стерилизации 6,

Выращивание проводили при 27с в течение. 21 сут. Ферментационная среда, %:кукурузНый экстракт 0,1 (по общему азоту) соевая мука 2,0, сернокислый аммоний 0,2; глюкоза 2,0, Крахмал 2,6/ мел 0,3/ рН до стерилизации б,7-6,8. При культивирований указанного штамма в колбах, содерх ащих 100 мл. ферментсСционной среды, прртеолитическая активность культуральной жидкости при рН 5, О на 5-е сутки роста составляла 2 оПЕ/мл. Молокосвертывающая активность культуральной жидкости 300 ЕД/ Время створаживания молока 1,5 мин.

Проведенные фармакологические исследования показали, что препарат кислой пррт1еиназы не токсичен при введении внутрь и мало токсичен при внутрибркииинном и внутривенном введении. Пероральное введение препарата мышам в дозах до 5000 мг/кг не вызывало гибели животных.

Формула изобретения

Штамм Acremonium chrysogenum ЛИА-Т-049 -,продуцент кислой протеинаэы.

Хранится в коллекции Всесоюзного научно-исследовательского технологического института антибиотиков и ферментов медицинского назначения под номером ЛИА-Т-049. Морфологические признаки. Культура образует неразветвленные несептированные конидиеносцы в виде боковых прямостоящих веточек до 30-90 х 2,0 мкм. Конидии эллипсоидные, одноклеточные, бесцветные, размером 3,0-4,5 X 1,5 мкм, собраны в плотны слизистые головки шириной 4,5-9 мкм длиной б мкм.

Типичные хламидоспоры отсутствую Гифы тонкие, слабо септированные, ветвящиеся, 1,5 мкм толщиной, в старых культурах распадаются на фрагменты, подобные артроспорам. Спорообразование чаще скудное. Культуральные признаки. Агар Чапека с глюкозой. Колонии светло-бежевые, на 8-й день роста достигают б мм в диаметре складчатые, сухие. Воздушный мицелий беловатый, пушистый. Растворимый пигмент отсутствует.

Сусло-агар. Колонии бледно-желтые, сухие, складчатые, достигают 10-12 мм в диаметре на 8-10-й день. Воздушный мицелий белый, пушистый. Растворимый пигмент отсутствует. Среда не окрашена.

Картофельный агар. Колонии светло-бежевые, сухие, тонкоскладчатые, 9-10 мм в диаметре, с пышным

белесым мицелием. 1Растворимый пиг-. мент отсутствует. Агар не окрашен.

Кукурузный агар-. Колонии желтоватые,., сухие, на 8-10-й день колонии достригают 12-14 мм в диаметре.. Воздушный мицелий беловатый., пушистый . Среда не окрашена.

Органическая среда с переваром Хоттингера. Колонии светло-бежевые. 6-8 мм в диаметре. Воздушный ми-

0 целий беловатый, слегка пушистый. Растворимый пигмент отсутствует.

Крахмало-аммиачный агар. Колонии светло-бежевые, сухие. Складчатые, до б мм в диаметре на 8-й день

5 роста. Воздушный мицелий белесый, пушистый. Растворимый пигмент отсутствует. Физиолого-биохимические.признаки. Усваивает как органический, так и

0 неорганический азот. Оптимальная температура для роста 23-25С. Оптимум рН 6,0-6,5. В качестве единственных источников углерода и энергии использует глюкозу, сахарозу, крахмал, арабинозу, ксилозу, мальтозу, маннит,

5 инозит.

Не усваивает фруктозу, рамнозу, галактозу.

Хорошо разжижает желатину, молоко коагулирует и пептонизирует, крахмал

0 гидролизует, растет на клетчатке. Антимикробных свойств штамм не проявляет .Источники информации, принятые во вяюланке при экспертизе

5

l.Watter Gams Ceppatospor I urn-arf i ge IchimmeCpi jzo (Tlyphomyceus ), Jena, 1971, p. 109 (прототип).