ПРОДУЦЕНТ КСИЛАНАЗЫ Советский патент 1972 года по МПК C12N9/42 C12N1/14 

Изобретение относится к области микробиологической промышленности.

Известны штаммы микроорганизмов, продуцирующие ксилаиазу, например Streptomyces xylophagus.

Предлагаемый штамм отличается от известного своими морфологическими, физиологическими и культуральиыми признаками. Он обладает высокой осахаривающей способностью. Под действием ксиланазы ксилан расш,епляется на за 15 мин, а под действием фермента Streptomyces xyiophagus степень гидролиза субстрата составляет 40% за 30 мин и 64% за 24 час при одинаковых оптимальных условиях действия фермента. Для выращивания Actinomyces sp. 7 используют дешевую и простую по составу среду.

Отличительной особенностью Actinomyces sp. 7 является также его способность накапливать ксиланазу за более короткий период культивирования (34-48 час вместо 72-120) у Streptomyces xylophagus, что может быть связано с наличием у этой культуры повышенного температурного оптимума роста 40°С. Повышенная температура культивирования способствует успешному проведению ферментации. По сравнению с другими известными продуцентами ксаланазы Actinomyces sp. 7 по активности этого фермента превосходит более чем в 1,5 раза наиболее активные мезофильные штаммы грибов Trichoderma viride 35, Chaetemium trilaterall 2264.

В препарате-сырце, который выделяют из культуральной жидкости путем высаливания сернокислым аммонием или осал дением этиловым спиртом, наряду с ксиланазой присутствуют активные ферменты Сутипа, входяш,ие в комплекс целлюлаз, а также Ci - фермент и целлобиаза.

Предлагаемый термотолерантный штамм Actinomyces sp. 7 культивируют при рН 6,8-7,0 с водопроводной водой на среде, содержащей, г/л:

Пшеничная солома со свекловичным жомом (1:1)21,35

KNOa5,0

KHsPOi3,5

MgSO4-7H2O0,625

CaCl2-2H2O0,1

Длительность культивирования 48 час в лабораторных условиях, 34 час - в ферментере на 100 л. Температура культивирования 40°С.

Штамм имеет следующую характеристику. М о р ф о л о г и я. Мицелий несептированный. Средняя толщина гиф 0,6-0,8 мк. Споры формируются на спороносцах, которые располагаются одиночно и образуют хорошо выраженные спирали с 3-4 растянутыми завитками. Величина спор 0,5-0,8X0,7-0,9 мк. Поверхность спор покрыта небольшими шипами. Культуральные признаки. На агаризованных питательных средах образует тонкие, плотные бесцветные колонии, покрытые рыхлым порошковидным слоем воздушного мицелия. Воздушный мицелий сначала имеет белый цвет, затем на третьи-пятые сутки роста становится серым. Часто сохраняются небольшие белые участки. Растворимого пигмента не выделяет. Споры в массе темно-бурого цвета, вследствие чего колонии с нижней стороны буроватые. Температура культивирования 30-50°С, оптимальная 40°С, при 60°С рост отсутствует. Хорошо развивается на простых синтетических средах с крахмалом или целлюлозой в качестве источника углерода. На богатых органических средах, а также на синтетических средах с сахарами рост заметно слабее. Рост на синтетических средах. Минеральная среда с глюкозой или сахарозой (СРТ: среда Чапека) - рост слабый, колонии бесцветные. Воздушный мицелий скудный, белый или серый, среда не окрашивается. Среда с крахмалом (среда Гаузе № 1 : крахмально-аммиачная среда; СР1 с крахмалом). Рост хороший. Колонии бесцветные. Воздушный мицелий темно-серый. Среда не окрашивается. Минеральная среда с клетчаткой. Рост хороший. Образуется серый воздушный мицелий. Субстрат не окрашивается. Рост на органических средах. Картофельный агар. Рост умеренный. Колонии сероватые. Воздушный мицелий пенельно-серого цвета. Ломтики картофеля. Рост хороший. КолоНИИ мелкие, бесцветные или сероватые. Нногда среда слегка темнеет. Глюкозо-аспарагиновая среда. Рост слабый. Колонии тонкие, бесцветные. Воздушный мицелий скудный, серый. Сусло-агар. Рост умеренный. Колонии мелкоскладчатые; пористые, рыхлые, грязножелтоватые. Воздушный мицелий скудный, белый. Мясо-пептонный агар. Рост умеренный, воздушный мицелий скудный, белый. Среда и колонии не окрашены. Физиолого-биохимические свойства. Желатину разжижает. Молоко коагулирует и пептонизирует. Крахмал гидролизует. Нитраты восстанавливает, клетчатку разлагает. Водород на среде Треснера-Кореняко не выделяет. Меланоидный пигмент на средах с тирозином не образует. Отношение к источникам углерода. Хорошо усваивает глюкозу, фруктозу, крахмал, декстрин, мальтозу, галактозу, маннит, глицерин, рамнозу, инозит, а также натриевые соли уксусной, лимонной, яблочной, янтарной, пировиноградной кислот. Хуже усаивает лактозу, арабинозу, ксилозу, маниозу, скулии и фумарат натрия. Слабо усваивает ахарозу, не усваивает инулин, дульцит и лактат. Отношение к источникам азота. Использует как минеральные KNOg; (NH4)2SO.i, так и органические - пептон, аланин, аспарагин, глицин и мочевину. Культура обладает слабой антибиотической активностью, Пример использования данного штамма для получения ксиланазы. Культивирование в лабораторных условиях проводят в колбах Эрленмейера е.мкостью 250 мл, с 50 мл среды на качалке с 180-200 об1мин. Состав среды с водопроводной водой еледуюший, г/л: Пшеничная солома со свекловичным жомом KNOa КН2Р04 MgSO4-7H20 CaCl2-2H20 Посевной материал вырашивают на агаризованной среде, состоящей из 50% картофельного отвара и 0,5% глюкозы, в течение 4-6 сут. Температура культивирования 40°С. Длительность глубинного культивирования 48 час. Культивирование в полунроизводственных условиях ведут в ферментерах емкостью на 100 л с 45 л среды. Аэрация 1 объем воздуха на 1 объем среды в 1 мин, скорость врашения мешалки 300 об/мин. Длительность культивирования 34 час. Посевной материал для ферментации выращивают в колбах на качалке в течение 1,5-2 суток на среде указанного выше состава. За единицу активности ксиланазы принимают такое количество фермента, под действием которого образуется 1 мг редуцирующих веществ в реакционной смеси. Состав реакционной смеси 50 мг ксилана (в виде порошка), 5 мл фосфатно-цитратного буфера, рН 6,5+1 мл 0,1%-ного раствора фермента или 1 мл фильтрата культуральной жидкости. Температура гидролиза 55°С, время гидролиза 15 мин. Редуцируюш;ие вещества определяют по методу Нельсона. Активность ксиланазы Actinomyces sp. 7 но степени гидролиза ксилана 60-70% за 15 мин (или 36 единиц редуцирующих Сахаров, в нересчете на ксилозу), на 1 мл фильтрата культуральной л ндкости. Предмет изобретения Штамм Actinomyces sp. 7 - продуцент ксиланазы. Морфология. Мицелий несептированный. Средняя толщина гиф 0,6-0,8 Л1К. Споры формируются на спороносцах, которые располагаются одиночно и образуют хорошю выраженные спирали с 3-4 растянутыми завитками. Величина спор 0,5-0,8X0,7-0,9 мк. Поверхность спор покрыта небольшими шипами.

Культуральные признаки.

На агаризованных питательных средах образуются тонкие, плотные бесцветные колонии, покрытые рыхлым порошковидным слоем воздушного мицелия. Воздушный мицелий сначала имеет белый цвет, затем на 3-5-е сутки роста становится серым. Часто сохраняются небольшие белые участки. Растворимого пигмента не выделяет. Споры в массе темпо-бурого цвета, вследствие чего колонии с нижней стороны буроватые. Температура культивирования 30-50°С, оптимальная 40°С, при 60°С рост отсутствует.

Рост на синтетических средах.

Минеральная среда с глюкозой или сахарозой (СРТ: среда Чапека) - рост слабый. Колонии бесцветные. Воздушный мицелий скудный, белый или серый, среда не окрашивается.

Среда с крахмалом. (Среда Гаузе № 1: крахмально-аммиачная среда; СР1 с крахмалом). Рост хороший. Колонии бесцветные. Воздушный мицелий темно-серый. Среда не окрашивается.

Минеральная среда с клетчаткой.

Рост хороший. Образуется серый воздушный мицелий. Субстрат не окрашивается.

Рост на органических средах.

Картофельный агар. Рост умеренный. Колонии сероватые. Воздушный мицелий пепельпосерого цвета.

Ломтики картофеля. Рост хороший. Колонии мелкие, бесцветные пли сероватые. Ипогда среда слегка темнеет.

Глюкозо-аспарагиновая среда. Рост слабый. Колонии тонкие, бесцветные. Воздушный мицелий- скудный серый. Сусло-агар. Рост умеренный. Колонии мелкоскладчатые, пористые, рыхлые, грязно-желтоватые. Воздушный мицелий скудный, белый. Мясо-пептонный агар. Рост умеренный, воздушный мицелий скудный, белый. Среда и колонии не окрашены.

Физиолого-биохимические свойства.

Желатину разжижает.

Молоко коагулирует и пептонизирует.

Крахмал гидролизует. Нитраты восстанавливает, клетчатку разлагает.

Сероводород па среде Треснера-Кореняко не выделяет. Меланоидный пигмент на средах с тирозином не образует.

Отношеппе к источникам углерода. Хорошо усваивает глюкозу, фруктозу, крахмал, декстрип, мальтозу, галактозу, манпит, глицерин, рамнозу, инозит, а также натриевые соли уксусной, лимонной, яблочной, янтарной, пировиноградной кислот.

Хуже усваивает лактозу, арабипозу, ксилозу, маннозу, эскулин и фумарат натрия.

Слабо усваивает сахарозу.

Не усваивает инулин, дульцит и лактат.

Отношение к источникам азота.

Использует как минеральные KNO3(NH4)2 SOJ, так и органические - пептон, аланин, аспарагип, глицин, мочевину.