Способ получения личинок геогельминтов Советский патент 1983 года по МПК A01K67/00 

Изобретение относится к ветеринарной .гельминтологии, в частности к культивированию личинок нематод в лабораторных условиях при изучении экологии экзогенных стадий развития нематод, влияния физических факторов среды и разработки новых методов профилактики нематодов сельскохозяйственных животных.

Известен способ получения личинок гео-гельминтов в лабо атории, который осуществляется следующим образом яйца, полученные из фекалий методами Iфлотации или осаждения, или яйца, полученные из гонад самок путем потрошения помещают в оптимальные для развития условия, используя в качестве среды воду, воду с фекалиями, опилки и др. Через определенное время (в зависимости от условий культивирования) выходят личинки, которых надо различ ными-способами собрать, очистить от частиц среды и микрофлоры антибиотиками, перед посевом на новую чистую среду для дальнейшего культивирования провести подсчет, отобрать необходимое i;x количество 1.

Недостатками способа являются . трудоемкость и низкий выход личинок.

Известен также способ получения личинок гео-гельминтов, включающий

выделение из самок нематод яиц, куль тивирование яиц на питательной среде и отделение вышедших личинок 2},

Недостатком данного способа является малый выход личинок, так как при промывании их антибиотиками и водой и переносе в другую среду част личинок теряется в период культивирования.

Цель изобретения - повышение вы.хода личинок гео-гельминтов.

Поставленная цель достигается тем, что перед выделением яиц самок нематод помещают в 3-5%-ный раствор ( -диэтиламиноизобутиронитрила на 2;:4.ч.

ъ -Диэтиламиноизобутиронитрил оказывает стимулирующее действие на яйца в гонадах живых самок. Через 1-1,5 сут после гибели самок в воде при 19-2 в тело ее выходят активные личинки. Они питаются внутренними органами, продвигаясь к вульварному или ротовому отверстиям, через которые могут выходить во внешнюю среду. Кроме того, при переносе самок из раствора в воду на них остаются частицы р -диэтиламиноизобутиронитрила, который ингибирует развитие микрофлоры в среде культивирования.

,ч-Диэтиламиноизобутиронитрил относится к химическому соединению, в частности к p-N-(диашкил) замещвнным насыщенный алифатическим аминонитрилам изостроения, и имеет формулу

СНз-С Нг

K-dHz-dH-diT dHj- dH Ыз

Структура (3-диэтиламиноизобутиронитрила подтверждается результатами ИК-спектроскопического анализа. В спектре соединения отмечаются полосы {см) диэтиламинной группы:

СНз-ЙНг

N-: СНз-СНг

780, 940, 1010, 1080, 1140, 2825. 2880, 294,0, 2980, 3200, 3450 и изобутиронитрильной группы;

СНз

830, 940. 1280, 1380, 2250, 2825, 2880. 2940, 2980. Подчеркнутые полосы имеют нахождение полос второго фрагмента.

Все эти полосы, имекядиеся в прилагаемом ИК-спектре, подтверждают структуру Ъ-диэтиламиноизобутиронитрила, который образуется в результате присоединения диаэтиламина к нютакрилонитрилу (см. чертеж).

Съемка проб производится на ИКспектрофотометру ИК-20 (К Цейсе Йена). Прозрачный жидкий образец снимается без растворителя в герметичных стандартных кюветах из KB г с толщиной 40-54 мкм.

Испытание соединения-в качестве стимулятора развития яиц и выхода личинок .геогельминтов и ингибитора мякрофлоры в лабораторных условиях проволят. в чашках Петри на гельминттах из родов Tr1cho5trong: eus , N6nna iiioiJiius, ДагеЬоЬНад- а и видов НосmoMclfius contovtu%и O5-be --fcag-ici

cif cuvwc ncta

Гельминтологический материал собирают из кишечного тракта овец и хранят до начала опытов (3-4 ч) при 28-32°С в термосе с физраствором.

Растворы р-диэтиламиноизобутиронитрила готовят в дистиллированной объемных процентах.

Всего поставлено 15 опытов в трех повторностях, пяти вариантах. В каждую чашу Петри вносят по 10-20 самок одного из названных видов нематод, в гонадах которых имеются зрелые яйца. По окончании экспозиции 70% самок, не отжатых дт раствора, переносят водопроводную дехлорированную воду. Контролем служат самки тех же видов, не обработанные раствором f -диэтиламинэизобутиронитрила содёржшциеся в тех же условиях. Температурные усяовия опытов 19-23°С. Наблюдения за поведением и развитием Объектов, проводят с помоии ю бинокулярной лупы М|БС-1 и кмкроскр па МБР-«1 дважды в сутки. В период массовохю выхода личинок В тбле самок обнаружено 16-2S живых активных личинок. П р и мер 1. Стимулирование развития яиц и личинок в самках Hocmonchos txjntbrttfs. Живых самок гёмоцхов помещаиот в чашки Петри с водным раствфом р-диэтилакв но«зрбутйр Нитрила 3 и 5%-иой концентраций на 1, 4 и 21 ч. По окончании экспозиции самок, еще «HBjjix, переносят (не отмывая f в 60- МП водопроводной вбды (70% самок). Через 24ч самки шбиут а через 48 ч после начала omiTg из яиц внутри тела самки начинают bf ходить ЛИЧИНКИ I стадаи, активно дви гаясь в перео даий тела, ягдаболе массовый BtjixoA их наблюдается при экспозиции в растБСфе 4 ч и 5%-нрЙ кониен ррации раствсфа в дехлорировав йой воде при 19-23 С. Начало выхода личинок - конец первых суток после гирели самки. Стимулирование развития яиц при помощи р - Ш1этиламиноизобУтиронитрила происходит только в -гонадах живых самок (табл. 1, пункт 1). П р и м е р 2. Действие раствора р -диэтилшинриэобутиронитрила на самок и яйца is них из рода:. ТНс юв .trorig-sPoe , Из табл. 1 Спуикт 2) видно, что стимулирующее действие i aicTBop оказывает также н« живьпе самок нематод. . Жишх самок трихостронгилид помещают в 2 и 5%-H.t раствр л, бнрлотшчески активного BeiaecTb на б сут 3 и .. 4 4,3атем, не отмывая,. в Ьодопро&одную дехлсфирован ную воду (табл. 1.). Наблюдения показали что длительная экспозиция самрк в раств(фе препятствует дальнейшему развитию якц - они гибнут. Наиболее эффективны условия: экспозиция самок а раствсфе 4ч при концентргац1И в объеме 5% я 19-2З С. 1ерез 1-1,5 су т после гибели самки в полость ее тела выходят личинки.

ё

I I

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИЧИНОК ГКО-ГЕЛЬМИНТОВ, включающий выделение из самок нематод яиц, культивирование яиц на питательной ереде и 6тделение вышедших личинок, о т л ич a ю itt и-й с я тем, что, с целью повышения выхода личино к, перед выделением яиц самок Нематод помещают в 3-5%-ный раствор; fi -диэ- иламиноизобутирони.трила на 2-4 ч.

X + + +1 I N R Ч R

S ;S f

+ . + о + +. X

+ X о + +

t Г:, $ I

+ :4 X + + +

+-fТ H+ -и + + + +

I n 4 1 II

1Л in I I

.: § «

о

XXI

- X - л

-.f , . С

о о 8

П in ,-П S

m

f X

g R К

A

а

h

а

S

При уменьшении экспозиции до 3 ч время начала выхода личинок увеличивается до 4 сут.

П р и м е р 3. Самок Oetertogia Circu«ici«cta , активных и ослабленных, шлдерживают в 5%-ном расгтворе (5-диэтиламин Эизобутиронитрила is течение 3 и 4ч. Активные, самки более восприимчивы к действию этого раствора: они быстрее гибнут и в их половом аппарате развитие яиц ускоряет- 10 ся - личинки выходят уже через сутки, тогда как в ослабленных самках глход личинок наблюдается лишь спустя 2 сут после их гибели. Табл. 1 (пункт 3) иллюстрирует этот вывод 15 и показывает, что трехчасовое действие 5%-ного раствора Р -диэтиламиноизобууиронитрила наиболее эффективно, личинок в этом случае формируется наибольшее количество. Длительное « действие раствора меньшей концентрации неэффективно.

Лучшими условиями для выхода личинок остертагий в теле самок при 19-23с можно считать: концентрацию je р -диэтиламиноизобутиронитрила 5%, экспозицию самок в растворе 3ч, среду культивирования - дехлсчрированную воду. Выход личинок наблюдается через 1-1,5 сут после гибели самок. .30

Пример 4. в тех же условиях зучается действие растворов р-дитила1 иноизобутиронитрила на самок ематод из рода Mars ibEEagia и Nema tiod-iVoe . Взрослые паразиты после 35 ействия раствора гибнут в те же сроки, что и описанные виды. В теле погибшей самки в течение первых трех сут идет развитие яиц, но затем оно прекратается и яйца гибнут. Для этих видов гельминтов свойственно длительное развитие яиц и личинок в них 1 или 2 линьки протекают в яйце. Личинки в теле самки для этих видов нематод не получена.

Стимуляция развития яиц и выхода личинок внутри тела самок р-диэтилакиноиэобутнронитрилом возможна для нематод стронгилоидного типа развития.

П р и мер 5. Во всех опытах при наблюдении за развитием яиц в теле самки нематод учитывается также степень развития микрофлоры по сравнению с контрольными вариантами (самки нематод, содержащиеся в чайках с дехлорированной водопроводной водой не подвергаюВДеся действию fi -диэтиламиноизобутиронитрила) .

Многократные наблюдения показывают, что 7-15 самок, не отьщтых от 5%-ного раствора р -диэтиламинойзобутироннтрила, перенесенные в 60-st) м воды, содержат достаточное количество вещества, способного подавить рост шкрофпоры в еде культивирования. В течение первых трех суток рост микрофлоры ингибирувтся полностью, в последующие 4-6 сут развивается единичное число микроорганизмов и только спустя 7-8 сут в среде культивирования появляется незначительное их количество, не мешающее развитию личинок (табл. 2).

В связи с этим проводят испытания различных концентраций (от 0,01 до 5,0%) р -диэтиламиноиэобутиронитрила как ингибитора микрофлоры. Результаты испытаний, представленные в табл.2, подтверждают гфрведенные наблюдения. 5

р -Диэтиламиноизобутиррнитрил, стимулируя развитие яиц в самках нематод, одновременно ингибирует в среде культивирования развитие микрофлоры.

Применение предлагаемого способу 10 обеспечивает ряд преимуществ в сравнении с изэестным,

Y Во-первых, так как яйца развиваютсй в полости тела самки, исключается процесс потрошения и их сбор, отнима-|5 кадий, как правило, болглиую часть вреМ&нн при постановке опытов (2-3 рабочих дня, Кроме того, отпадает необходимость работы с «дакроскопическими объектами, во-вторых, после гибели 20 самок под действием р -диэтиламиноичобутиронитрила в гонадах развиваются все зрелые яйца; исключена возможность их механического повреждения, обеспечен учет дефектных и незрелых яиц;

в-третьих, нет необходимости очищать .среду от остатков тел нематод, которые, как правило, слуткаг пищей гнилостной микрофлоре, кроме того, на этом этапе экономится время,

в-четвертых, исключается процесс отмывания личинок и очистка среды от избытка микрофлоры, так как даже в очень незначительных дозах р -диэтиламиноизобутиронитрил сам ингибирует рост микроорганизмов, а значит, от падает потребность в антибиотиках и эконс «ится время

в-пятых, так как личинки сконцентрированы в теле нематоды, исключается учет личинок неизаестногр вида, что важно для диагностики личинок на разшлх стадиях разви;тия« этот способ дает возможность ПЕЯ{ вырас вании личинок проводить диагностику самок (видовую) .