@ -Нитроанилиды пироглутамилсодержащих пептидов в качестве субстратов сериновых протеиназ Советский патент 1984 года по МПК C07K5/113 C12N9/50 C12Q1/00 C12Q1/37 

Предлагаются новые хромогенные производные пептидов, которые могут использоваться в качестве субстра,тов при определении активности прот литических ферментов, относящихся к сериновым протеиназам. Они могут найти применение в медицине, пищево п ромышл е н нос ти, мик робиологни. Для определения активности ферментов удобно использовать производ ные пептидов, содержащие хромофорну группу, что позволяет следить за хо дом расщепления субстрате - по измене нию окраски раствора спектрофотомет рически. В качестве таких хромофорных субстратов описано использовани п-нитроанилидов С 1 : Z-Gly-Pro, Z-Ala-Pro-Leu, Z-Ala Leu, Z-Gly-Pro-Leu, Z-Asp-Pro-Leu, Z-Ala-Val-Arg, Z-Lys-Leu-Arg. Известно использование в качеств субстратов для субтилизина BPN-прои водных пептидов общей формулы Z-A-B-d-WH I - бензилоксикарбонильная группа; и В- остатки глицина или L-ал нина ; - остатки. L-лейцина или L-фенилаланина. Разница в положении максимума погло щения этих производных (315 нм) и максимума поглощения п-нитроаналина, отщепляквдегося в процессе фер ментативного гидролиза (375 нм), по зволяет следить за ходом гидролиза спек трофо томе т риче с ки 23. Однако наличие гидрофобных групп приводит к плохой растворимости эти соединений в воде. Поэтому их приме нение возможно только в водно-орГанических растворах а присутствие органического растворителя (в данном случае диметилформамида) неблагоприятно влияет на каталитическую активность ферментов, оказывая ингибирующее действие. Таким образом, область применения описанных субстратов достаточно ограничена, и их использование не дает истинных значений удельной активности ферментов. Целью изобретения является повышение эффективности субстратов, рас ширение области их применения. Поставленная цель достигается описываемыми п-нитроанилидами пироГJiyтaмилcoдepжaщиx пептидов общей формулы Z,-p(ilu-A-A-B-NH

где А - остаток глицина или Ц-аланина;

В - остаток L-лейцина или L-фенилалаиина.

Аналогично получают п-нитроанилид L-пиpoглyтaмил-L-aлaнил-L-фeнилaлaнина, выход 50%, т.пл.213-217°С, 5 .СоЗ 5°-16(с 0,5, диме тилформамид). которые обладают более высокой растворимостью в воде по сравнению с известными соединениями. Это позволяет снизить концентрацию диметилформамида при проведении ферментативной реакции с этими производными от 20% (в случае бензилоксикарбонильных производных) до 4% (для глицинсодержащих пироглутамилпроизводных) и до 0,2% (в случае аланинсодержащих пироглутамилпроизводных). Такое содержание органического растворителя не оказывает заметного ингибирующего действия на протеолитические ферменты. п-Нитроанилиды пироглутамилпептидов указаннойобщей формулы получают конденсацией в присутствии дициклогексилкарбодиимида пироглутамилпептида pGlu-A-A и п-нитроанилида L-лейцина или п-нитроаналида L-фенилаланина. Если А - остаток Ь-аланина, в реакционную смесь добавляют N-оксисукцинимид. Пример. п-Нитроанилид L-пироглутамил-ь-аланил-ь-аланил-Ь-лейцина. 0,2 г (0,74 ммоль) L-пироглутамил-ь-аланил-ь-аланина и 0,018 г ( ммоль) п-нитроанилида L-лейцина растворяют в 10 мл абсолютного диметилформамида. К раствору при О С и при перемешивании добавляют 0,08 г (0,74 ммоль) N-оксисукцинимида и раствор 0,2 г (0,9 ммоль )N,Kдициклогексакар.бодимида в 5 мл абсолютного диметилформамида. Реакционную смесь перемешивают 3 ч при 0®С, затем 20 ч при комнатной температуре. Отделяют осадок фильтрованием, фильтрат упаривают в вакууме досуха. Остаток растворяют при слабом нагревании в 5 мл п-бутилового спирта, затем прибавляют 10 мл этил-; ацетата и смесь оставляют на холоду на 24 ч. Отфильтровывают Ы,к-дициклогексиломочевину, объем раствора доводят до 20 мл, добавляя 5 мл пбутилового спирта, и раствор промывают 1%-ным раствором бикарбоната натрия (2-5 мл) и водой (2-5 мл). Высушивают раствор над N280 и упаривают в вакууме досуха. Остаток кристаллизуют под эфиром и перекристаллизовывают из спирта, выход 0,22 г (60%), т.пл.261-264°С , Id j,-16(c 0,5, диме тилформамид). Найдено,% : С 54,18; 54,22; Н 6,25;: 6,45; N 16,23, 16,30. ,«S 75; Н 6,39; Вычислено. И 16,16. Найдено, %: С 58,20; 58,12,- Н 5,65; 5,65;N 15,12; 15,07, . Вычислено, С: С 59,97,- Н 5,62; N15,61. Также получают п-нитроанилид L-пироглутамилглицилглицил-ь-фенилаланина, выход 59%, т.пл. 165-170 с, eiJ2+16(c 0,5 диметилформамид). Найдено,%: С 56,61; 56,70; Н 5,21; 5,23jN 16,08. Вычислено.%: С 56,45; Н 5,15;М 16,46. Синтезированньте п-нитроанилиды пироглутамнлпептидов использовали в качестве субстратов при определении протеолитической активности субтилизина BPN ,о6-хикютрипсина, эластазы, про-теиназы .из Termoactinomyces Vulgaris. Значения удельной активности этих фесментов, определенной по полученным Удельная активность субтилизина BPN по микромоль Г-иЛг-ТПЯТЯМ......у t --- субстрата|й, JHH.опт.ед.фермента субстратам и по субстратам, описанным ранее, приведены в табл.1, 2,3 Из таблиц видно, что изменение концентрации органического растворителя существенно влияет на скорость ферментативного гидролиза. Так,для субтилизина БРН при уменьшении концентрации диметилформамида в 20 раз удельная активность фе1жюнта, определяемая по синтезированным субстратам, возрастает в 8 раз, удельная активность эластазы при снижении концентрации диметилфорамида от 20 до 1% возрастает в 9 раз. Хорошая растворимость синтезированных п-нитроанилидов пироглутамилпептидов в воде открывает широкие воз можности использования их в энзимологии в качестве реагентов, а также в промышленности и медицине при определении содержания ферментов. /Таблица 1 пептидным

п-Нитроанилиды пироглутамилсодержащий пептидов формулы L--pQla-A-A-B-iiH- NOt ;где А - остаток глицина или L-сшани на; В - остаток Ь-лейцина или L-фенилаланина, в качестве субстратов сериновых протеиназ.

Z-L-ata-L-ata-L-Leu-flH i,-pGlu-L-aia-L-ala-L-Y-eu-NH-/ L-p&tu-L-ala- -ota-L-PЛe-NH 2- Vty-4/ly-L-Phe-N

i-p(lu-4yty-«i /lg-L-Phe-lJH Удельная активность в(-химотрипсина по микромоль

)

1,3

0,030,05

0,01 ; уыОг о,38 1,4 . Ф а б л и ц а 2 пептидным субстратам,

it-p tu-L-ala-L-aia-L-beu-V

I 0,030,20 L-p&lu-L-afa-L-a(a-L-Phe-li)

Z-4/lc/-««ly-L-Phe-NH4 -pGlu-4/ly-4 ty-/:.-PJie-NH-% yHOj

2-L-Qla-L-aia-L-Leu J:m.-( J-VOt h-p&iu-L-aia-L-aia-L-L uУдельная активность сериновой протеиназы из Termoactinomyces Vulgaris, микромоль

Продолжение табл. 2

0,01

0,04

0,36

Таблица 4

мии.опт.ед.фермента SH-{ yNO«;o,04 0,12 1,5 ,3,3 0,008 0,06 0,08