Способ ферментативного получения пептидов Советский патент 1988 года по МПК C07K5/62 C07K5/83 C07K5/103 

Изобретение относится к способам ферментативного получения пептидов, который может быть использован в синтезе биологически активных соединений.

Цель изобретения - упрощение процесса ферментативного синтеза пептидов.

Исходные материалы,

Карбопепсидаэу-Y, получаемую из хлебопекарных дрожжей, выделяли с помощью хроматографии средства, предложенной Йохансеном, и производили в виде лиофшшзированного порошка (10% фермента в лимонно-кислом нат- рие),Перед использованием фермент обессоливали на установке Sephadex 025 fine (1,5-25 см), уравновешивали и вымывали дистиллированной водой. Концентрацию фермента определяли спектрофотометрически при условии

2вонА% Приготавливали основной раствор с концентрацией 7 мг/мл (110 мкмоль)5 хранивишйся при -21 С, аликвотными порциями .по 250-500 мл. Использовали бензоилаланинметиловый эфир (Bz-Ala-OMe), выпускаемый фирмой Бахем, Лиштапь, Швейцария. Бо- ро-трифторидный эфировьш комплекс (для синтеза), растворители и реактивы (все аналитической чистоты) приобретали у фирмы Мерк, Дарм- штадт, ФРГ. Все аминокислоты, аминокислотные амиды и их производные закупали у фирмы Сигма Кемикал Ком- пани, Сан-Луис, С1ЧА. Карбобензил- оксифенилаланинметиловый эфир (Z-Phe ОМе) изготавливали в соответствии с процедурой Ямада и др. и использовали в виде сиропа. Фенилаланингид- разид, аланингидразид и аланингидра- зидгидрохлорид изготавливали из эфи- ров в соответствии с описанием Лос- се и др. Нескорректированные т,пл. составляли 86-88 и 184-185 с (по известным данным 82-83 и 184-185°С соответственно). Аспарагинамиддигид- рохлорид получали из аспартановой кислоты и диэтилового эфира по Фишеру с помощью классического аминоли- за (т.пл. 210-214 С, по известршм данным 214-215 с). Другие исходные материалы приобретали у указанных фирм или производили аналогичным образом.

Определение выходных продуктов. Чистоту определяли количественно с помощью TLC на силикагеле 60

0

Fg, (Мерк). Применяли растворитель- ную систему CllClg (СК (СН,,), «OH(CHjCOOH) (11:5:2:1), Пятна визуально проверяли на тушение флуоресценции для оценки состава реагентов.

Состав реагентов определяли количественно на установке обращения фазы HPLC с помощью столба RP-8,10 мкм (Мерк)-и хроматографа Хьюлетт Пакард 10845 снабженного регистратором переменной длины волны (модель 79875,А). Разделение обеспечивали при исполь5 зовании соответствующих удельных

градиентов в системах вымывания, составляющих от 10% CHjCN в 10 ммоль НаАс (рН 4) до 100% или от 10 ммоль NaAc (рН 4) до 100% .

Q Последнюю систему использовали для таких соединений, как Bz Ala-Gly-OH, Bz-Ala-Ala-OH, Bz-Ala-Ser-OH, и соответствующих амидов о Скорость протекания 3 мл/мин, температура столба

5 , рабочая длина волны 260 нм. Выходы определяли из молярного отношения реагентов, которое находили по интегрированным площадям под пиками вымывания.

Идентификация продуктов. Пятна идентифицировали методами кохроматографии тонких слоев с соответствующими стандартными соединениями. Некоторые продукты идентифици- .ровали с помощью сочетания метода

HPLC и аминокислотного анализа. Лпя этого из смеси реакции через 10 мин забирали аликвотные пробы объемом 1 мл и реакцию останавливали добавлением 250 мкл 6 М НС1, После это- го рН доводили до 4 с помощью КаОН и смесь разделяли методом HPLC с помощью оборудования фирмы Уотерс, включающего два насоса, программное устройство составления растворителей

модели .660j инжектор модели Ь бК, регистратор переменной длины волны модели 450, совмещенный с самописцем (радиометр 61), или f Мописец- интегратор фирмы Хьюлетт-Пакард,

0 модель 3380А, Управление вымыванием осуществляли с помощью сканирования на подходящей длине волны от 255 до 280 им. Хроматографию осуществляли методом обратной фазы с помогаю

5 столба Уотерс С-18м-Бондапак в

системе вымывания 20 об,% ТЕАР (три- метиламмониефосфатный буфер) в метаноле с соответствующими градиентами и скоростью потока 1,5-2,0 мл/мин.

Буферный раствор ТЕАР изготавливали по методике Ривьера. Во многих случаях удовлетворительные результаты обеспечивали в системе 0,1 М НАс, рН 3, 20 об.%, и 0,1 М НАс, рН 3 в метаноле.

Вытекающий поток, содержащий Ы- ацилдипептиды, собирали вручную и доводили до сухости путем лиофили- зации или на установке Бюхи Рото- вап при 35-45 С, Малые пробы остатков гидролизовали в 6 М НС1 при в вакууме з течение 36 ч, Испаренные гидролизаты анализировали на аминокислотном анализаторе типа Даррум Л-500.

Синтез со свободными аминокислотами в качестве аминовой компоненты

Пример 1.2мл 0,6 М раствор валина 0,1 М КС1, 1 м EDTA при рН 9,8 смешивают со 100 мкл (0,1 ммоль) 1 М раствора Bz-Ala-OMe (растворенны в 96%-ном этаноле). Реакцию прово-, дят в рН-стате при 35°С и рН 9,8, ) причем значение рН поддерживают постоянным путем автоматического добавления 0,5 М ИаОН. Реакцию инциируют добавлением 0,7 мг карбокси- пептидазы-У (150и/мг, производство Де ФореНеде Брижерье). После про- текания реакции в течение 30 мин, реакцию останавливают с помощью доведения рН до 1 при посредстве 6 М НС1 Продукт реакцииочищают и выделяют с помо1цью хроматографии при высоком давлении. Выход Bz-Ala-Val-OH составляет 40%. Количественный анализ аминокислоты после гидролиза продукта в 6 М НС1 в течение 24 ч дает соответственно 1,0 моль аланина и 1,0 моль валина. .

Влияние рН,,температуры и концентрации субстратной компоненты, ами- новой компоненты и CPD-Y на выход Bz-Ala-Val-OH+CHjOH изучали с до- мощью пяти серий экспериментов, проведенных аналогично описанной процедуре. В каждом из экспериментов изменяли один из указанных параметров при постоянстве остальных четы- рех: 0,6 М валин; 55 ммоль Bz-Ala-OM 4,5 мкмоль CPD-Y; рН 9,7; 35°С. Полученные результаты показали, что диапазон оптимальных значений рН довольно узок и составляет всего 0,5 ед. рН, возрастание температуры, реакции приводит к почти линейному возрастанию синтеза из-за относительно слабого гидролиза. При температу

15

25

20 3035 40

45 Q

5

pax выше 45 снижение активности фермента и неферментативный гидролиз эфиров становятся неприемлемы- ми. При более низких температурах при рН до 10,0 гидролиз эфиров был пренебрежимо мал в течение 10 мин реакции. Однако он становился существенным при снижении скорости ферментативной реакции, когда длительность реакции возрастала до 2-5 ч.

Выход Bz-Ala-Val-OH увеличивался при возрастании концентрации аминовой компоненты. Обратная зависимость наблюдалась между выходом и концентрацией субстратной компоненты для Bz-Ala-OMe. Это обстоятельство с учетом зависимости выхода от высокой концентрации фермента позволяет найти оптимальное отношение субстрата к концентрации фермента.

В присутствии 0,5 М валина субстрат Bz-Ala-OMe быстро преобразовывался (в течение 20 мин) в 38% Вг-/й.а -Val-OK и 62% Bz-Ala-OH. Эти цифры показывают также, что дипептид не. гидролизовался при рН 9,7 в присутствии избыточного валина. Если р11 доводили до 5-8, то весь Bz-Ala-Val- OH гидролизовался за несколько секунд. Такое избирательное поведение CPD-Y при высоких рН является свойством, имеющим важное значение при синтезе пептидов.

Пример2. 2 мл раствора 3 М лизина, 0,1 М КС1, 1 мМ EDTA при pFi 9,8 смещивают с 400 мкл 100%-ного метанола и 100 мкл {0,1 ммоль) 1 М Z-Phe-OMe (растворенного в 100%-ном метаноле). Реакцию проводят аналогично примеру 1, ионизируя -добавлением 0,7 мг карбоксипептидазы-У. Через 30 мин рН доводят до 1 с помощью 6 М НС1. Продукт реакции очищают и вьщеляют способом хроматографии высокого давления Выход Phc-Lys-OH достигает 60%. Количественный анализ аминокислот производившийся аналогично примеру 1, показал, что в продукте содержался 1 моль лизина и 1 моль фенилаланина.

Пептиды, представленные в табл.1, производили из указанных исходных материалов аналогично примерам 1 и 2. Эксперименты выполняли в радиометрическом рН-стате, а выходы определяли на установке HPLC. Поддерживали значения: 4,5 мкМ CPD-Y; рП 9,7.; .

Синтез с амидами аминокислот в качестве аминовой компоненты.

И р и м е р 3, 2 мл раствора 0,6 М метионинамида (Met-NH), 0,1 М КС1, 1 мМ EDTA при рН 9,8 смешивают со 100 мкл (0,1 ммоль) раствора 1 М Bz--Ala-OMe в 96%-ном метаноле. Реакцию проводят аналогично примеру 1, инициируя добавлением 0,7 мг карбок- сипептидазы-Y. Через 30 мин после начала реакции значение рН доводят до 1 с помощью 6 М НС1. Продукт реакции очищают и выделяют способом хроматографии высокого давления. Выход Bz-Ala-Met-NH 95%. Количественный аминокислотный анализ, проводившийся так же, как в примере 1, показал, что продукт содержал 1,0 моль Ala, 1,0 моль Met и 1,0 моль NH.

В течение 20 мин субстрат почти полностью превращался в дипептид (95%), а 5% гидролизовалось. до Bz-Al ОН,

11ример4. 2мл раствора 0,4 валинамида (Val-NH), 0,1 М КС1, 1 Ml l EDTA при рН 9,5 смешивают со 100 мкл (0,1 ммолъ) раствора 1 М Bz- А1а-ОМе в 96%-ном метаноле. Реакцию проводят, как в примере 1, Продукт реакции Bz-Ala-Val-NHg осаждают во время реакции. Через 20 мин после начала реакции рН доводят до 1 и осадок выделяют центрифугированием,Продукт растворяют в 1 мл мета НОЛ а 5 очища1от и выделяют способом хроматографии высокого давления. Выход Bz-Ala-Val-NH составляет 95%, в то время как в примере I при использовании свободной аминокислоты в качестве аминовой компоненты, он был равен.только 40%, Количественный анализ аминокислоты, проводивщий ся так же, как в примере 1, показал что продукт содержал 1,0 моль Ala, 1,0 моль Val и 1,0 моль NH.

Зависимость протекания реакции от значения рН и от концентрации валинамида.

Реакции) проводили аналогично описанному синтезу, причем постоянные параметры составляли: 0,6 М валинами да; 55 мМ Bz-Ala-OMe; 4,5 мкМ CPD-Y рН 9,7; 35°С.

Полученные результаты показали, что выход практически не зависит от концентрации валинамида.

Эффективное значение рН вапинами да не превышает 9, значение рН 9,8

0

5

0

5 30 5

0

5

50

5

является верхним пределом, после которого выход сразу уменьшается.

Аналогично примерам 3 и 4 пептиды, приведенные в табл. 2, приготавливают из указанных исходных материалов. Эксперименты выполняют в следующих условиях: 4 мкМ CPD-Y; рН 9,6; 35 С. Концентрация субстрата приведена в табл. 2.

П р. и м е р 5. Синтез с аминокислотными гидразидами в качестве аминовой компоненты.

Аналогично примерам 3 и 4 пептиды, приведенные в табл.3 приготавли-. вали из указанных исходных материалов. Эксперименты проводили при 35°С, рН 9,6 в присутствии 4,5 мкМ CPD-Y. ..

П р и м е р 6. Синтез с аминокислотными зфирами в качестве аминовой компоненты.

Эксперименты с аминокислотными эфирами проводят так же, как в примерах 1-4: в радиометрическом рН- стате при рН от 9,0 до 9,7 и 23-35 С. Продукты и выход определяют с помощью HPLC. Концентрация CPD-Y составляла от 4,5 до 11 мкМ.

В табл. 4 приведены пептиды, получаемые из указанньпс исходных материалов. Видно, что в отдельных случаях имела место некоторая олигомери- зация. Поскольку выходы обычно очень высоки, то аминокислотные зфиры можно считать пригодными для дальнейшего ограничения олигомеризации.

Пример7.Ь-и D-стереоизо- меры в качестве аминовой компоненты.

Пептиды, приведенные в табл. 5. были получены из исходных продуктов так же, как в примерах 1-4 и 6.

Видно, что включаются только L- изомеры, В результате процесс становится экономичным,поскольку исключается необходимость очистки исходных аминокислот для получения чистого Ь иэомера.

П р и м е р 8. Изменения субстратной эфирной группы.

Пептиды, приведенные в табл. 6, были получены из указанных исходных материалов так же, как в примерах 1-4.

Результаты доказывают гибкость предлагаемого способа по отношению к выбору субстратов.

П р и м е р 9. Депсипептиды в качестве субстратов.

Как в примерах 3 и 4, пептиды, приведенные в табл. 7, были получены из указанных исходных материалов Процесс проводили в присутствии 4,5 мкМ CFD-Y при рН 7,6 25°С.

Из табл. 7 видно, что обеспечиваются очень высокие выходы.

Пример 10. Пептиды в качестве субстратных компонент.

Пептиды, приведенные в .табл. 8, были получены так же, как в примерах 1-4. Эксперименты проводили в радиометрическом рН-стате; выходы определяли с помощью HPLC. Постоянно поддеживали следующие параметры: 4-25 мкМ CPD-Y, рН 7,6 при .

Зависимость синтеза пептидов от рН.

В.тех случаях, когда синтезируемы пептиды являются неподходягдими субстратами для CPD-Y, синтез может выполняться при значениях рН предпоч- тительно 9-10,5.

Пример 11. Так же, как в примерах 1 и 3, пептиды, приведенные в табл. 9, были получены в рН-стате при указанных значениях рН.

Опыты проводили при 25 С в присутствии 15 мкмоль CPD-Y.

Другие аминовые компоненты.

Пример 12. Пептиды, приведенные в табл. 10, были получены так же, как в примерах 3 и 4. Эксперимен ты выполняли в рН-стате, выходы определяли с помощью KPLC. Опыты проводили рН 4,5 мкМ CPD-Y, рН 9,5, .

Пример 13. Синтез пептидов с ячменными карбоксипептидазами.

Прорастающий ячмень, например, в виде солода содержит две различные карбоксипептидазы, обозначаемые СР-1-1 и СР-2-1.

СР-1-1 и СР-2-1 изолировали по методике Рэн; пептиды, приведенные в табл. 11, были получены так же, как в примерах 1-4, из .указ анных исходных материалов. Поддерживали следующие условия: 6 мкМ СР-1-1 или

СР-2-1, рН 8.0. 25°С.

Пример 14. Диамидация пептидных амидов при катализе карбоксипеп- тидазой.

К 2 мл раствора 15 мМ Bz-Ala-Leu- NHg в О, М КС1, 1 мМ EDTA (рН 9,7, в 10%-ном диметилформамиде добавляли 2 мг CPD-Y. Результаты определяли с помощью HPLC, как в при

10

5

20

5

5

0

0

5

0

5

мере 1. Видно, что Bz-Ala-Leu-NH через 20 мин полностью преобразовывался в 68% Bz-Ala-Leu-OH и 32% Bz-Ala-OH. Аминокислотный анализ среды реакции показал, что Bz-Ala-OH образуется главным образом в результате отщепления Leu-NH от Bz-Ala- Leu-lJH 2.

Пример 15. Сравнение пептидно-эфирных субстратов с И-концевыми защитными группами и без них.

Так же, как в примерах 3 и 4, пептиды, приведенные в табл. 12,были получены в следующих условиях: 50 мМ субстрата, 5 мкМ CPD-Y, рН 9,5, 25°С.

Пример 16. Синтез в присутствии органических растворителей.

Так же, как в примерах 1-4 и 6, пептиды, приведенные в табл. 13-15. были получены из указанных исходных материалов при указанных концентрациях органических растворителей.

Поддерживали следую1и 1е условия: 50 М.М субстрата, 5 мкМ CPD-Y, рН 9,6,

. .

П р и м е р 17. Нерастворимая (лишенная подвижности) карбоксипеп- сидаза-Y.

CPD-Y присоединяли к реактиву Конкавалин-А-Сефароза 4В, выпускаемому фирмой Фармацна Фаин Кеми- калз, после чего формировали перекрестные связи между CPD-Y и Конка- валином А с глутаральдегидом, как описано Хсиас и Ройером. Концентрация CPD-Y составила 3 мг на расфасованную Сефарозу.

Пептиды, приведенные в табл. 16, бьши получены так же, как в примерах 1 и 3, при следующих условиях: 50 мМ субстрата, 0,25 мл геля CPD-Y {5 мкм CPD-Y); рН 9,7; . После удаления фермента путем фильтрации продукты и выходы определяли с помощью HPLC.,

Пример 1в. Амиды пептидов в качестве субстратов.

Раствор 5 мл Bz-Ala-Leu-NH в 0,10 М KCL, I мл Е)ТА в присутствии 10%-ного диметилформамида при рН 10,и, 25 С смешивали с 0,25 М вапин- амида.

Реакцию инициировали добавлением 40 мМ CPD-Y и проводили аналогично примерам 3 и 4. Bz-Ala-Leu-Yal-NH вьщеляли методом HPLC с выходом порядка 65%.

Реакцию повторяли с использованием Bz-Ala-Flifr-NHj в качестве субстратной компоненты. Bz-Ala-Phe-Yal-NH, выделяли методом HPLC с выходом по- рядка 44%.

П р и м е р 19. Синтез мет-энке- фалина.

Ступенчатый синтез мет-энкефали- на при использовании в качестве исходного вещества 5 г Bz-Ai-g-Oet и в присутствии CPD-Y в качестве катализатора проводили по следующей схеме: синтез мет-энкефалина с использованием в качестве катализатора CPU-Y; выход для каждой стадии приведен в скобках.

Изобретение относится к пептидам, в частности к способу ферментативного получения пептидов общей формулы А-В, где А Н-концевой L-ами- нокислотный остаток или пептидный остаток состава 2-6 L-аминокислот, содержащий L-аминокислоту (АК) на его С-терминальном конце и необязательно защитную группу на N-терми- нальном конце; В Ъ-аминокислотиый остаток, который может быть С-терми- напьно защищен, применяемых в син- . тезе биологически активных соединений. Цель изобретения - упрощение процесса. Синтез пептидов ведут из аминокислотной (АКК) и субстратной компонент (СК) в растворе в присутствии фермента. В качестве АКК используют выбранные из группы соединения Н-В-ОН (в указано вьше); амид с необязательно N-замещенной АК формулы H-B-NHR ; сложный эфир АК формулы H-B-OR, где В указано выше; ОН; С -С4-алкил; ,-C4- алкил. В качестве СК используют выбранное из группы соединение: сложный эфир аминокислоты или пептида, или депсипептида формулы А - ОН,; амид АК или пептида формулы A-NHj или пептид формулы А.-Х, где А указано вьше; ,-С4-алкил, бензил или б г-дезамино-фрагмент Gly, Ala или Phe; А,Ъ-Ж-ИЛИ ди-пентапептид; . Процесс целесообразно проводить в дисперсии или з водном растворе, содержащем до 20% органического растворителя (низшего алканола, диметилформамида или полиэтиленгли- коля) при рН 7,6-10,5, 25-45 0 и исходной концентрации СК 0,01-0,15 моль и АКК 0,05-3 моль с последующим выделением необязательного защищенного пептида, после чего при необходимости отщепляют группы Rj и R( с помощью серинкарбоксипептидазного энзима ( карбоксипептидаза-У из дрожжей или карбоксипептидазы СР-1-1 или СР-2-1 из проростков ячменя). Способ обеспечивает возможность проведения процесса в широком интервале рН 7,6- 10,5 при меньшем расходе фермента (до 2-25 ммоль). 2 з.п. ф-лы, 16 табл. S Од ч1 00 00 СП о

Bz-Arg-Oet рН 9,6 ерл-у

I H-Tyr-NH2 BZ-Arg-Tyr-NH (85°/о) рН 9,6СРГНУ

BZ-Arg-Tyr-OH (90%) EtOH/HCl

H-Tyг-Gly-Gl /-Phe-Mel-OH (95%) рН8,0 f Trypsin

Bz-Arg-Tyt -Gly-Gl:y-Pbe-Met-OH(75o/oV. рН9,5 1CPD-Y

IH-Met-OH

Bz-Arg-Tyr-Gly-Gl -Phe-Oel (80Vo) IrtOH/HCl

Bz-Arg-Tyi: -Oei (80% Bz-Arg-T /r-Qiy-Gly-Phe-OH (95%)

pH9,0CPD-ypH9,5 ICPD-y

IH-Gly-OeiB7.-Arg-Tyr-Gly-Gly-Oet (60%) Bz-Atg-Tyr-Gly-Gly-Phe-iqH2 (65%) CPD-y, pH-8,0

Стадии катализируемой CPD-Y конденсации и деамидирования проводили в чистой водной фазе, а Bz-Arg был выбран в качестве солюбилизиругощей защитной 1 руппы, которая может быть удалена на последней стадии с помощью трипсина. После расширения пептида под воздействием амида амино- кислоты с последующим деамидировани- ем, следующий пептидно-сложноэфирный субстрат синтезировали с помощью аб- салютированного этанола и безводной НС1. Прсле каждой стадии реагенты выделяли методом препаративной HPLC. Таким способом могут быть также регенерированы избыток ашшной компоненты и побочные продукты гидролиза .

Предлагаемый способ позволяет уп- ростИть процесс ферментативного получения пептидов за счет использования экзопептидая вместо применявшихся ранее ферментов, каждый из которых проявлял доминирующую или по мен шей мере значительную эндопептидазну активность, что позволяет расширить набор аминньте и субстратных компонент, использовать ферментативный

процесс для синтеза многозвенных биологически активных пептидов, Например энкефалина, значительно сократит использование защитных групп, проводить стеноспецифический синтез, снизить расход фермента до концентрации 2-25 мкмоль, проводить процесс в более широком диапазоне рН (7,6-10,5 с получением стабильного высокого выхода целевого продукта.

Формула изобретения

с целью упрощения процесса,в качестве субстратной компоненты используют компоненту, выбранную из группы, содержащей сложные эфиры аминокислот, сложные эфиры пептидов и деп- сипептидов формулы A-OR, где значения А указаны выше, R - С -С«-алкил бензил или альфа-дезамино-фрагмент Gly, Ala или Phe-, амиды аминокислот или пептидов формулы A-NH, где значения А указаны выше, пептиды формулы А,-Х, где L-аминокислота или ди-пентапептид, X - L-аминокислота, а в качестве аминной компоненты используют компоненту, выбранную из группы, содержащей аминокислоты общей формулы Н-В-ОН, где значения Б указаны выше, амиды необязательно N-замещенной аминокислоты формулы H-E-NHR, где значения Б указаны вы- Dje, Rj - водород, оксигруппа, ами- но, С -С -алкил, сложные эфиры аминокислоты формулы Н-В-ОН., где значения Б указаны выше.

Р- 4 - С, -С -ал- кил, и процесс ведут в присутствии L-специфического серин- или тиоалкил Т а б л и ц а 1

Синтез пептидов с катализацией карбоксипептидазой-Y при использовании свободных аминокислот в качестве аминовой компоненты

Лейцин (0,17 М) Фенилаланин (0,16 М)

Серин (3,2 М) Треонил (0,7 М) Метионин (0,6 М) Лизин (1,5 М) Аргинин (и,8 М)

Аспарагиновая кислота (1,0 М)

0

5

0

5

карбоксипептидазного энзима, который вводят в реакционную массу в концентрации от 2 до 25 мкмоль, процесс ведут в водном растворе или дисперсии при рН 7,6-10,5, 25-45 0 при исходной концентрации субстратной компоненты 0,01-0,15 моль, аминной компоненты, 0,05-3,000 моль с последующим выделением необязательно защищенного пептида, после чего в случае необходимости отщепляют группы R 2 или К с помощью серинкарбокси- пептидазного энзима.

24 27

50 24 46 56 26

0

131378785,4

Продолжение табл. 1

Глутаминовая кислота

(1,2М) Bz-ALa-Glu-OHО

Метиловый эфир глутами- . новой кислоты (1,ОМ) Bz-Ala-Glu(OMe)-OH 30

Bz-Ala-OMe Изолейцин (0,15М) Bz-Ala-He-OH40

(50 №М)

Глутамин (0,5 М) Bz-AJ.a-Cln-OH 20

0 трет-бутиловый эфир

аспаргиновой кислоты

(0,3 М)Bz-Ala-Asp/0 U/-OH 30

Триптофан (0,05 М) Bz-Ala-Trp-OH I O Гистидин (1,ОМ) Bz Ala-His-OH15

Z.-Phe-OMe Валин ( М)Z-Phe-Val-OH6

(55 мМ)

Лизин (3,0 М) . Z-Phe-Lys-OH60

(пример 2)

Bz-Phe-Gly-ОМе (30 мМ) Валин (0,6 М)Bz-Phe-Gly-rVal-OH 40

Z-Ala-OMe Глицин (2,0 М) Z-Ala-Gly-OH30

(10 мМ)

Алании (0,7 М) . Z-Ala-Ala-OH60

Лейцин (0,15 М) Z-Ala-Leu-OH2

Лизин (1,5 М)Z-Ala-Lys-OH 60

Bz-Gly-OMe Глицин (2,0 М) Bz-Gly-Gly-OH63

(20 мМ )

Ac-Phe-OFt . .

(50 мМ) Алании ,(0,8 М) Bz-Phe-Ala-OH85

Z-Ala-Ala- Глицин (2,0 М) Z-Ala-Ala-Gly-OH 40 -ОМе (10 мМ)

Лейцин (0,15 М) Z-Ala-Ala-Leu-OH О

Фенилаланин (0,15 М) Z-Ala-Ala-Pfte-OH О

Z-Ala-Phe- Глицин (2,0 М) Z-Ala-Phe-Gly-OH 35 -ОМе (10 мМ)

Лейцин (0,15 М) Z-Ala-Phe-Leu-OH О

Z-Ala-Ser- .

-ОМе (Ю мМ) Лейцин (0,15 М) . Z-Ala-Ser-Leu-OH 40

15

Лейцин (0,15 М)

Лизин (1,5 М) Глицин (2,0 М)

Лейцин {о, 15 Mj Глицин (2,0 М) Лейцин (0,15 М) Глицин (2,0 М) Лейцин (0,15 М) Фенилаланин (0,15 Mj Лизин (1,5 М) Лейцин 0,15 М Лизин ( l ,5 М / Аланин (1,7 М j

Таблица 2

Синтез пептидов при использовании аминокислотных амидов в качестве аминовой компоненты; катализатор - карбоксипептидаза-Y

(пример 4)

Лейцинамид (0,3 М)Bz-Ala-Leu-NH

Метионинамид (0,6 М)

(пример 3), Bz-Ala-Met-NH

Фенилаланинамид (0,3 М) Bz-ALa-Phe-NH

Тирозинамид (0,6 М)Bz-Ala-Tyr-NH Аспарагинамид (0,3 М) Bz-Ala-Asn-NH.

1378785

16

Продолжение табл. I

3

Z-Ala-Val-Cu-OH

Z Ala-Val-Lys-OH

Z-Ala-NLe i-Gly-OH

Z-ALa-NLeu-I eu-OH

Z-ALa-Met-Gly-OH

Z-ALa-Met-Le i-OH

Z-Ala-Trp-Gly-OH

Z Ala-Trp-Leu-OH

Z-Ala-Trp-Phe-OH

Z-Ala-Trp-Lys-OH

Z Ala-Ala-Tj r-Leu-OH

Z-Ala-Ala-Tyr-Lys-OH

Z-Ala-Ala-Tyr-Ala-OH

85

95 90 90. 80

-ОМе (1 О мМ)

Z-Thr-Pro- -ОМе (25 мМ)

Z-Ala-Ala- -Туг-ОМе (10 мМ)

Z-Tyr-Gly- -Gly-OMe (20 мМ)

Валинамид (0,2.М) Глицинамид (О,15 М) Лейцииамид (0,15 М)

Z-Thr-Pro-Val-NHj 95 Z-Ala-Ala-Tyr-Gly-NH .J 100 Z-Ala-Ala-Tyr-Leu-NHj 100

Фенил ал анинамид (0,2 М) Z-l -r-Gly-Gly-Phe-NH 40

Продукт осаждался.

ТаблицаЗ

Катализированный карбрксипептидазой-Y синтез пептидов с аминокислотными гидраэидами в качестве аминовой компоненты

Вг-А1а-ОМе Аланингидразид (0,6 М) Bz-Ala-Ala-NH-NHg

ФенилаланингиДразид ..

(0,3 М). Bz-Ala-Phe-NH-NH,

Z-Thr-Pro-Val-NHj 95 Z-Ala-Ala-Tyr-Gly-NH .J 100 Z-Ala-Ala-Tyr-Leu-NHj 100

37

80

Таблица 4

Катализированный карбоксипепсидазой-Y синтез пептидов с аминокислотными эфирами в качестве аминовой компоненты

Глицинпропиловый эфир (0,5 М)

Глицинизопропиловый эфир (0,5 М)

Глицинбутиловый эфир (0,5 М)

Лейцинметиловый эфир

(0,5 М)

Лейцинэтиловый эфир (0,25 М) .

Лейцин 1 бутиловьга эфир (0,25 М)

Фенил аланинметшювый эфир (0,25 М)

Фенилаланинэтиловый эфир (0,15 М)

Метиловый эфир (t-Bu) глутаминовой кислоты (0,5 М)

(if-t-Bu) t-бутиловый эфир глутаминовой кислоты (0,25 М)

Метионинметиловый эфи .(0,2 М)

Метионинэтиловый эфир (0,2 М)

Bz-Ala-Gly-OH

Bz,-Ala-Gly-OH

Bz-Ala Gly-OH

Bz-Ala--Leu-OH Bz Ala Leu-Leu-OH Bz-Ala-Leu-Leu-Leu-OH Bz-Ala-Leu-Leu-Leu-Leu- -OH

Bz-Ala-Leu-OH Bz-Ala-Leu-Iieu-OH 50

Bz-AJ-a-Leu-OHО

Bz-Ala-Phe-OH

Bz-Ala-Phe-Phe-OH 80 Bz-Ala-Phe-Phe-Phe-OH

Bz-Ala-Phe-OH Bz-Ala Phe-Phe-OH

70

Bz-Ala-Glu(-t-Bu)-OH 35

Bz-Ala-Glu(-t-Bu)-OH О

Bz-Ala-Met-OH Bz-Aba-Met-Met-ОН Bz-Ala Met-Met-Met-OH Bz-Ala-Met-Met-Met-Met OH

Bz-Ala-Met-OH40

c-Phe-OEt 50 мМ)

z-Gly-OMe 50 мМ)

Me тиониниз опропиловый эфир (0,2 М)

Валинметиловый эфир (0.7 М)

Серинметиловый эфир (0,5 М)

Тирозинметиловый эфир (0,5 М)

Аргининметиповьй эЛир (И,5 М)

Аргинин (NOj) метиловый эфир (0,5 к)

Гистидинметиловый эфир (0,5 М)

Треонинметиловый эфир

(0,5 М)

Аланинметиловый эАир (0,5 М)

Bz-Ala-Met-OH

Bz-Ala-Val-OH Bz-Ala-Val-Va

Bz-Ala-Ser-OH

Bz-Ala-Tyr-OH

Bz-Ala-Arg-OH

Br-Ala-Arg(NO.

Bz-Ala-His-OH

Bz-Ala-Thr-OH

Ac-Fne-Ala-OH Ac-Phe-Ala-Ala

Гистидинметиловый эфир Bz-Gly-His-OH

Таблица 5

Катализированный карбоксипёптндазой-Y синтез пептидов с L- и D- изомерами в качестве аминовой компоненты

Bz-Ala-Met-OH

Bz-Ala-Val-OH Bz-Ala-Val-ValBz-Ala-Ser-OH

Bz-Ala-Tyr-OH

Bz-Ala-Arg-OH

Br-Ala-Arg(NO. )-OH

Bz-Ala-His-OH

Bz-Ala-Thr-OH

Ac-Fne-Ala-OH Ac-Phe-Ala-Ala-OH

Bz-Gly-His-OH

Таблица 6

Выход { в % ) в синтезе пептидов с использованием различных эфирных групп в качестве субстратных компонентов при катализе карбоксипептидазой-Y

Таблица 7

Катализированный карбоксипептидазол-Y синтез с депсипептидами в качестве субстратных компонент.

Таблица 8

Катализированный карбоксипептидазой-Y синтез пептидов при использовании пептидов в качестве субстратов

Глицинамид f1,3 М)

Таблица 10

Катализированный карбоксипептидазой-У синтез пептидов при различных аминокислотных производных в качестве аминовой компоненты

-Аланинамид (0,2 М)

Глицингидроксаминовая кислота (0,2 М)

D,Б-аланингидроксами- новая кислота (0,2 М)

Глицин ti -метиламид (0,50 М)

Таблица

Синтез пептидов с использованием карбоксипептидаз из проростков ячменя

СР-1- или СР-2-1

NK5,0 9,5 9,0

5 77 95

8,0 100 7,0 97 6,0 44

Bz-Ala-Ala-NHj 80

Bz-Ala-Gly-NH-OH 75

Bz-Ala-Ala-NH-OH 50

Bz-Ala-Gly-NH-CH;| 20

31137878532

Таблица 12

Сравнение катализируемого карбоксипептидезой-У синтеза пептидов при использовании в качестве субстратов пептидных эфиров с N-концевыми защитными группами и без них

Аминовая компонента (концентрация)

Лейцинамид (0,15 М) Лейцинамид (0,15 М)

Таблица 13

Катализированный карбоксипептидазой-Y синтез пептидов при использовании 50 мМ Bz-Ala-OMe в качестве субстрата и свободных аминокислот в качестве аминовой компоненты при наличии и отсутствии 20% метанола (МеОН) в 0,1 М КС1, 1 мМ EDTA

Продукт

Выход,

%

Ас-А1а-А1а-А1а- -Leu-NHj90

Ala-Ala-Ala-Leu- -NH ,

75

Таблица 14

Катализированный карбоксипептидаэой-Y синтез Bz-Alk-Tlir-OH из В7. (50 мМ) и треонина при различных концентрациях полизтиленгликоля-300 (PEG-300). Условия: CPD-Y 4 мкМ; рН 9,6; 25 с

О

10 20 30 40

Таблица 15

Катализированный карбоксипептидазой-Y синтез пептидов из 50 мМ Bz-A.a-OMe и указанных аминокислотных эфиров в качестве аминовой компоненты в 3%-ном полизтиленгликоле. О , 1 М КС1, 1 мМ E1DTA Другие условия: CPD-Y 8 мкМ; рН9,6; 25°С

Глутаминовая кислота Bz-Ala-Gly-OH (-OBut)-OMe (0,5 М) (jf-OBut )-ОН

Фенилаланин-ОМе (0,5 М)

L-Метионин-ОМе (0,5 М)

D-Метионин-ОМе (0,5 M)

36 34 31 29 28

38

Bz-Ala-Phe-OH Вг-Ala-Phe-Phe-OH

Bz-Ala-Met-ОН Bz-Ala-Met- blet-OH

Bz-Ala-Met-Met-Met

Bz-Ala-D-Met-OH

Таблица 16,

Катализируемые нерастворимой карбоксипептидазой-Y синтезы

пептидов .

Bz-Ala-OMe Фенилаланин (0,15 М) Bz-Ala-Phe 21 (50 мМ) . ,

. Лейцинамид (0,2 М) Bz-Ala-Leu-NH. 91