Способ получения пептидов Советский патент 1991 года по МПК C12P21/00 

1 (89) DD 257174 (48) 08.06.88

(21)7774327/13

(22)03.11.86

(31JWPC 12 Р/284889

(32)20.12.85

(33) DD

(46)23.07.91. Бюл. №27

(71)Научный центр по биотехнологии (DD), Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов(51)5

(72)Ульрих Корн (DD), А.Л. Остерман, В.М. Степанов, Т.Л. Воюшина. Л.А. Люблинская (SU), Райнер Грунов (DD)

(53) 668.392 (088.8)

(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ (57) Изобретение относится к способу получения пептидов, особенно Z-Ala-A a-Leu-p- нитроанилида и Z-L-Asp-L-Phe OMe (аспартама) в присутствии металлопротеи- наз. Цель изобретения - повышение выхода трипептидов (Z-аспартама). Способ заключается в связывании Z-Ala-Aia с Leu-p-нитро- анилидом и Z-L-Asp с L-PheOMe-HCI в присутствии протеиназы из Bacillus cereus ZIMET 10700 Металлопротеиназуиспользуют в виде фильтрата культуральной жидкости или очищенного афинной хроматографией с бацитрацин-силохромом. 1 з.п ф-лы

Изобретение относится к способу получения пептидов, особенно Z-ALA-ALA-LEN-P-нитроанилида и Z-L-ASP-L-PHEOME (аспартама) в присутствии металлопротеиназ. Цель изобретения - повышение выхода трипептидов (Z-аспартама). Способ заключается в связывании Z-ALA-ALA с LEN-P-нитроанилидом и Z-L-ASP с L-PHEOME-HCL в присутствии протеиназы из BACILLUS CEREUS ZIMET 10700. МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗУ ИСПОЛЬЗУЮТ В ВИДЕ ФИЛЬТРАТА КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ ИЛИ ОЧИЩЕННОГО АФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ С БАЦИТРАЦИН-СИЛОХРОМОМ.

Изобретение относится к способу по получению пептидов, особенно Z-Ala-Ala- Leu-p-нитроанилида и Z-L-Asp-L-PheoMe (аспартама), в присутствии металлопротеи- наз.

Из обзора ISOWA, V, Vu ki Case Kagaku Kycka aishi, 36, 1978, 195-20 известен способ получения пептидов с использованием протеиназ в качестве катализаторов. При этом используются серинпротеи- назы и металлопротеиназы разного биологического происхождения из Bacillus polymyxa, Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteolyticus и др.

Недостатком данного способа является то, что эти ферменты требуют глубокой очистки.

Из описания патента ФРГ № 3203292, кл. С 12 Р 21/00, опублик 1985 известен способ получения пептидов путем связывания Z-Ala-Ala с Leu-p-нитроанилидом и Z-L(Л

С

Asp с Zthe-оме-НС в присутствии металлопротеиназы.

Недостатком этого способа является .о, что при этом образуется незначительное количество трипептидов

Целью изобретения является повышение выхода целевых продуктов

Металлопротеиназа из В.cereus ZIMET 10700 применяется для получения пептида Z-Ala-Ala-Leu-р-нитроанилида или пептида Z-L-Asp-L-PheOMe, при этом установлено, что этот ферментможноиспользоватьтакже в виде фильтрата культуральной жидкости или очищенного аффинной хроматографией с бацитрацин-силохромом

Эффективность синтеза выше, если применяется очищенный фермент. Действенным методом очистки для металлопротеиназы из Вас. cereus ZIMET 10700 является аффинная хроматография с бацитрацин-силохромом В результате очистки получают

о

4

оэ

4 СЛ

фермент, почти свободный от углеводов и чужих протеинов. Этот фермент позволяет повысить скорость реакции и выход конечного продукта.

Пример 1. 74 мг Z-A a-Ala и 62 мг Leu-p-нитроанилида растворяют в 250 мкл диметилформамида и смешивают с 500 мкл

50мМ трис-HCI, рН 7,5, с 1 мм Са-ацетата, при 35°С и добавляют 180 мкл фильтрата культуральной жидкости из Вас. cereus ZIMET 10700, содержащего 140 мкг фермента. Концентрация субстратов при этом составляет по 200 мкмоль. При перемешивании в течение 25 ч при 35°С получено

51% продукта. Качественный анализ конеч- ного продукта проводят тонкослойной хроматографией на силикагельных пластинках

в системе н-бутанол : пиридин : уксусная кислота : вода в соотношении 10:15:3:12, а детектирование в ультрафиолетовом свете после обработки нингидрином и с помощью KJ после хлорирования. Кроме этого, для качественного и количественного определения конечного продукта применяют HPLC. Детектирование проводят у аб- сорбционного максимума р-нитроанилина (315 нм) после отделения субстрата от продукта в С18-коло нке в ацетонитрильном градиенте. Дополнительно определяют выход Z-Ala-Ala-Leu-р-нитроанилида гравиметри- ческим методом после повторной промывки NaHCO, и водой.

Пример 2. 74 мг Z-Ala-Ala и 62 мг Leu-p-нитроанилида растворяют в 250 мкл диметилформамида и смешивают с 300 мкл 50 мМ трис-HCI, рН 7,5, с 1 мМ Са-ацетата. Общий объем составляет 900 мкл, а концентрация субстратов по 250 мкмоль. После чего доводят температуру до 35 °С, добавляют 10 мкг фермента из Вас, cereus ZIMET 10700, очищенного аффинной хроматографией, и перемешивают 18 ч при 35°С. Выход Z-Ala-Ala-Leu-р-нитроанилида составляет 72%.

Пример 3. 24,4 мг Z-Asp растворяют в 30 мкл 6 н. NaOH и 42,2 мг PheOMe-HCI, растворяют в 200 мкл диметилформамида и смешивают с 300 мкл 50 мМ трис-HCI, рН

7,5, с 1 мМ Са-ацетата. После нагрева до 35°С добавляют 100 мкл фильтрата культуральной жидкости, содержащего 110 мкг фермента. После перемешивания в течение 24 ч выход составляет 38%, Качественное и количественное определение Z-аспартама соответствует методу примера 1, причем детектирование разделенного HPLC продукта проводят у 220 нм.

Пример 4, 122 мг Z-Asp растворяют в 160 мкл 6н. NaOH и 211 мг PheOMe-HCI в 800 мкл 50 мМ трис-HCI, рН 7,5, с 1 мМ Са-ацетата. После нагрева до 35 С добавляют 1 мг фермента, очищенного аффинной хроматографией, в 100 мкл 50 мМ трис-HCI, рН 7,5, с 1 мМ Са-ацетата. В результате перемешивания в течение 24 ч получают выход Z-аспартама 54%.

Пример 5. Способ осуществляют как в примере 4, причем четвертное количество реактандов растворяют в 2,5 мл 50 мМ трис- HCI-ном буфере, рН 7,0, с 1,0 м.М Са-ацетата. После повышения температуры до 35°С добавляют 3 мг фермента, очищенного аффинной хроматографией. Через 5 ч перемешивания твердый осадок удаляют центрифугированием, а надосадочную жидкость снова инкубируют. Образующийся в течение следующих 5 ч осадок опять центрифугируют и определяют количество Z-аспартама. Общий выход составляет 85%.

Формула изобретения

2.Способ по п.1, о т ли чающийся тем, что, металлопротеиназу используют в виде фильтрата культуральной жидкости или очищенную афинной хроматографией с бацитрацин-силох ромом.