Способ очистки протеолитических ферментов Советский патент 1984 года по МПК C12N9/50 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в част ности к области получения высокоочи щенных и высокоактивных ферментных препаратов, которые могут быть использованы в медицине, биохимии и пищевой промышленности, в производстве моющих средств, а также для исследовательских целей. Наиболее перспективным для избирательной очистки ферментов является метод аффинной хроматографии, основанный на сродстве ферментов к специфическим аналогам субстрата или ингибиторам, ковалентно связанным с нерастворимым носителем, что позволяет разделять ферменты на основе их биологической специфичности, а потому достигать более высокой степени очистки по сравнению с другими видами хроматографической техники, Наиболее широко выделение ферментов биоспецифической хроматографией ведут с помощью биоспецйфических сорбентов, представляющих собой нерастворимые носители - производвые агарозы, активированные бромцианом и ковалентно связанные с лигандами - веществами специфическими для данного класса ферментов. Известен способ очистки протеолитических ферментов путем биоспецифической сорбции ферментных растворов на нерастворимом носителе, представляющем собой производное агарозы сефарозу Зв, который ковалентно связан с лигандом посредством конденсирующего агента (бромциана) с последующей десорбцией сорбированных ферментов, причем в качестве лиганда используют антибиотик-полипептидбацитрацин, являющийся неконкурентны.. ингибитором ряда протеиназ. Очистку проводят при рН 1,8-8,0, Десорбцию осуществляют солевыми буферами или буферами с добавлением органических растворителей JLJ , Выход ферментов по активности достигает 86%, степень очистки 295 раз в зависимости от чистоты исходного препарата. Данный способ обладает рядом ненестатков. Применяемая сефароза 4в является (Импортным дорогостоящим продуктом, Кроме того, недостаточная механическая прочность производных агарозы и способность их разрушаться под воздействием некоторых ферментов, сопут ствующих очищаемым протеиназам, огра ничивает возможности применения сефарозы. Недостатком данного способа является также применение высокотоксичного бромциана. Указанный способ не обеспечивает достаточной эффективности процесса очистки, гак как сорбенты., полученны на основе сефарозы, содержат от 0,8 до 8 мкмоль лиганда на 1 мл влажного сорбента. Такая концентрация лиганда не позволяет добиться максимальной сорбции фермента на единицу объема колонки. Для обеспечения более эффективного процесса очистки в ряде случаев полезно увеличить концентрацию лиганда, что позволяет увеличить выход ферментов по активности и чистоте. Целью изобретения является повышение эффективности процесса за счет увеличения выхода ферментов высокой степени чистоты и активности, а также удешевление и упрощение процесса. Указанная цель достигается предлагаемым способом очистки протеолитических ферментов, путем сорбции ферментсодержащих растворов при рН, большем или.равном 1,8, на нераство- РИМОМ носителе, который предварительно вводят во взаимодействие с раствором конденсирующего агента и лигандом, И десорбции . сорбированных ферментов солевыми буферами или солевыми растворами органических растворителей, причем в качестве носителя используют аминопроизводное кремнеземсодержащего материала, а процесс ведут при рН 1,8-9,5 в зависимости от рН-оптимума фермента. Кроме того, в качестве носителя используют аминопроизводный кремнеземсодержащий материал. Процесс ведут при рН 1,8-9,5. В качестве носителя предпочтительно используют аминопроизводные макропористого микросферического кремнезема типа Поросил или Силохром (обычно-- аминосилохром) имеющие внутри зерен крупные поры более или менее однородного размера. Они отличаются высокой механической и термической стабильностью. Кроме того, важным преимуществом макропористых кремнеземов по сравнению с другими материалами того же назначения, например сефарозой, является высокая химическая чистота, строго контролируемый размер пор, возможность достижения больших скоростей фильтрации и легкость стерилизации, Оилохромы выпускаются в больших количествах отечественной промышленностью и являются значительно более дешевым продуктом чем сефароза. Используемый в способе аминосилохром характеризуется высоким, содержанием реакционноспособных аминогрупп, что дает возможность повысить содержание лигандов от б до 100 мкмоль на 1 мл влажного сорбента, а также обладает лучшими по сравнению с сефарозой гидродинамическими свойствами, что позволяет увеличить скорость и производительность процесса очистки. В качестве конденсирующих агентов для связи носителя с лигандом обьлчно используют п-бензохинон, или карбодиимид, или гексаметилендиизоцианат. В качестве лиганда используют обычно п- (U)-амин омет ил) -фенилборную -O- i-Cfflj-dHj-dH -NH +l Hjd-d o Нгй-С1 0 NH,dH,/ В (он). /j)-N.c N-dHz-dH2-dH ОН -o- i-dH -dHz-dHz-NH-dАнтибиотики-полипептиды, используемые в качестве лигандов, являются ингибиторами карбоксильных протеиназ. Этим обусловлено специфическое взаимодействие сорбента с протеолитическими ферментами различных классов. Присутствие в молекулах антибиотиков D-аминокислот и характерные для циклопептидов особенности пространственной структуры препятствуют их расщеплению ферментами.

Бацитрацин представляет собой природный циклододекапептид, содержащий три D-аминокислоты. Бациллихин - отечественный препарат, аналогичный бацитрацину, выпускается в больших количествах промышленностью для использования в животноводстве. В молекуле другого природного циклододекапептида, грамицидина С, преобладают гидрофобные аминокислоты. В отличие от бацитрацина, в составе которого имеются дикарбоновые аминокислоты, а грамицидине С содержится больше нейтральных аминокислот, а также диаминокислота - орнйтин. Тонкие различия в строении молекул лигандов усиливают специфичность сорбентов к различным протеиназам. В ряде случаев грамицидин-С-силохром и бацитрацин-силохром являются взаимодополняющими сорбентами: фермент, который не сорбируется на одном из них, можно успешно хроматографировать на другом. Эти свойства можно

I

использовать для разделения смеси, содержащей два протеолитических фермента.

Используемая в качестве п- {Cj-аминометил) фенилборная кислота обладает групповой специфичностью по отношению к классу сериновых протеиназ, образуя лабильные комплексы с функциональными группами активного центра фермента.

При очистке карбоксильных протеиназ обь1чно .используют носители, содержащие в качестве лиганда антибиотик-полипептид, а процесс ведут при. рН 1,8-5,0.

При очистке сериновых протеиназ обычно в одном случае используют носители, содержащие в качестве лиганда антибиотик-полипептид, и процесс ведут при рН 6,0-8,5, в другом случае используют носители, содержащие в качестве лиганда п-(СО-аминометил) фенилборную кислоту, и процесс ведут при рН 6-9,5, предпочтительно 7-8.

Сорбцию сериновых протеиназ предпочтительно ведут при дополнительном присутствии глицерина, а десорбцию в присутствии раствора многоатомных спиртов, например пентаэритрита.

Важным преимуществом описываемого способа является возможность его применения для очистки препаратов ферментов, содержащих в качестве примесей большое количество целлюлаэ, кислоту или антибиотик-полипептид: бацитрацин, бациллихин, грамицидин С. Конденсация носителя с лигандом с помощью конденсирующего агента 5 иллюстрируется следующей схемой duflcxpaff J4NH2-(dN-dO-NH) R HjCizO-rfi-OCzHj Анти иотикполипептид2-K О .H -dHz-d-KH-dHz-/ VBfoH) декстранаэ и ферментов, способных гидролизовать агарозу. Неорганическ носители на основе макропористого кремнезема устойчивы к действию ферментов и бактерий. Описываемый способ позволяет исключить применение высокотоксичного бромциана, зам нить дорогостоящий импортный продук сефарозу отечественными носителями, повысить эффективность процесса очистки. Описываемый способ позволяет очи щать с выходом 75-100% различные протеолитические ферменты с увеличе нием активности в 1,5-100 раз в зависимости от чистоты исходного препаратаСпособ особенно эффективен при извлечении ферментов непосредственн из культуральной жидкости, содержащ окрашенные примеси. В таких случаях выделяются практически чистые ферменты, причем вследствие высокой из бирательности сорбентов значительны эффект достигается в одностадийном процессе очистки. Кроме того, описываемые биоспеди фические сорбенты могут быть пригленены для работы с растворами в широ ком диапазоне рН (1,8-9,5), Это дае возможность использовать их для выделения протеолитических ферментов различных классов, включая карбокси ные, сериновые, тиоловые, металлопротеиназы и экзопептидазы. Способ осуществляют следующим образом, Для синтеза носителей, необходимых для очистки требуемого фермента используют производные, макропористы кремнеземов, например аминосилохром который обрабатывают смесью конденсирующих агентов и лигандоЕ в соответствующих буферных системах. На пример, для очистки карбоксильных протеиназ - смесью, содержащей бензохинон и антибиотики-полипептиды, для сериновых протеиназ - смесью, содержащей янтарный ангидрид, п-(Со-аминометил)фенилборную кислоту и водорастворимый карбодйимид. Сорбцию ферментов проводят в дин мическом или статическом режиме Пр этом происходит избирательное связываЕ ие протеиназ с нерастворимым носителем. Затем носитель со связанным белком промывают соответствующим бу ферньом раствором. При этом происходит отделен.ие примесей, в том числе и окрашенных. Для десорбции используют растворы солей различной концентрации. В тех случаях, когда фермент связывается с сорбентом настолько прочно что его не удается элюировать, применяют растворы солей, к последним добавляют .органические растворители способствующие более эффективной десорбции. Очищенный фермент используют в виде раствора или высушивают лиофильно после обессоливания гельфильтрацией или диализа. В приведенных примерах по очистке ряда протеиназ на колонке с биоспецифическими сорбентами количество нанесенного и элюированного белка измерено в мг, а также в условных оптических единицах, т.е. в единицах оптической плотности при 2ЙО нм. Активность ферментов измерена по скорости гидролиза гемоглобина (пример 1, 2); по .ск орости створаживания молока (примеры 3 - 6) , по скорости расщепления синтетических субстратов: о;-карбоксипропионилфенилаланина (пример 7) и п-нитроанилида карбобенэокси-1.-аланил-1-аланил-1-лейцина (пример 8). Пример 1. Очистка промышленного препарата пепсина свиньи на бацитрацин-силохроме. Для синтеза бацитрацин-силохрома используют 1 г аминосилохрома (340 мкмоль аминогрупп на 1 г) в 0,1 М ЫаНСОз , рН 10,0, 34 мг п-бен зрхинона в 2 мл абсолютного диметилформамида и 220 мг бацитрацина. Смесь осторожно перемешивают 4 ч и оставляют на ночь при 5°С. Затем сорбент тщательно промывают 0,1 М NaliCO-j с рН 10, водой, спиртом, а перед опытом всеми элюирующими растворами. Полученный темноокрашенный сорбент по данным аминокислотного анализа содержит 46 мкмоль бацитрадина на 1 г сухого сорбента. Для очистки пенсина 0,1 М ацетатный буферный раствор с рН 5,0, содержащий неочищенную протеиназу с удельной активностью 23 е.а./о.е., пропускают через хроматографическую колонку (5x0,5 см), заполненную бацитрацинсилохромоме Затем сорбент промывают исходным буфером. Активный фермент элюируют 25%-ным изопропиловым спиртом в 1 М NaCg с рН 5,0, Удельная активность пепсина свиньи в элюате 34 е.а./мг. Выход по активности 100%, очистка в 1,5 раза. Пример 2. Очистка промышленного препарата пепсина свиньи на бациллихин-силохроме. Промышленный препарат бациллихина содержит нерастворимый наполнитель . Для извлечения бациллихина препарат трижды экстрагируют кипящим метанолом или этанолом. Экстракты упаривают в вакууме до небольшого объема. Осадок бациллихина, выпавший при охлаждении, отфильтровывают и высушивают. Для .синтеза бациллихин-силохрома с пользуют 100 г аминосилохрома

(120 мкмоль аминогрупп на 1 г) в 0,1М МаПСО-з, рН 10, 864 мг п-бензохинона в ЬО мл абсолютного диметил.формамида и 12,8 г бациллихина. Смесь осторожно перемешивают 4 ч и оставляют на ночь при . Затем сорбент тщательно промывают О,1М NaHCO-, рН 10, водой, спиртом, а перед опытом всеми элюирующими растворами. Полученный темноокрашенный с ербент по данным аминокислотного анализа содержит 16 мкмоль бациллихина на 1 г сухого сорбента. Для очистки пепсина 0,1М ацетатный буферной раствор м рН 5,0, содержащий неочищенную протеиназу с удельной активностью 22 е.а./о.е., пропускают через хроматографическую колонку (5x0,5 см), заполненную бациллихинсилохромом. Затем сорбент промывают исходным буфером. Активный фермент элюируют 2Ь%-ным изопропиловым спиртом в 1М NaCg, рН 5,0. Удельная активность пепсина свиньи в элюате 34 е.а./мг. Выход по активности составляет 100%, очистка в 1,5 раза

Пример 3. Очистка протеиназы из Trichoderma Eignorum на бацитрацин-силохроме.

Синтез бацитрацин-силохрома осуществляют по примеру 1. О,1М ацетатный буферный раствор с рН 5,0, содержащий 4 Г-белка (неочищенную смесь протеиназ и целлюлаз) с удельной активностью 13,0 е.а./о.е,, пропускают через хроматографическую колонку (6x1,5 см), заполненную бацитрацин-силохромом. Затем сорбент промывают исходным буфером и элюируют последовательно 1М NaC в том же буфере и 25%-ным изопропанолом в 1М NaCB, рН 5,0. Собирают солевую (1) и изопропанольную (11) фракции элюата, содержащие активный белок. Удельная активность фракции 1 216 е.а./о.е. Очистка в 16,6 раза. Удельная активность фракции 11 58,6 е.а./о.е. Очистка в 4,4 раза. Выход активного белка 97%.

Пример 4. Очистка ультрафильтрата культуральной жидкости базидального гриба Russula dec dorans Fr-0456 на бацитрацин-силохро-ме.

Синтез бацитрацин-силохрома осуществляют по примеру 1. Ультрафильтрат культуральной жидкости с удельной активностью 13 е.а./о.е. по створаживанию молока пропускают через хроматографическую колонку (6x1,5 см), заполненную, бацитрацинсилохромом и уравновешенную 0,1М ацетатным буфером, рН 4,5. Затем сорбент промывают исходным буфером и последовательно элюируют 1М NaCI, рН 4,5 в том же буфере (фракция 1) и 25%-ным изопропанолом в 1М NaCI рН 5,0 (фракция 11). Удельная активность фракции 1 - 664 е.а./о.е..

очистка в Ы раз, фракции 11 260 е.а./о.е., очистка в 20 раз: Выход, активного белка 100%.

Пример 5. Очистка ультрафильтрата культуральной жи,дкости базидального гриба Russula decdorans Fr-04b6 на бациллихин-силокроме.

Синтез бациллихин-силохромг. осуществляют по примеру 2. Ультрафильтрат культуральной жидкости, с удельной активностью 3,3 е,а./о„е. пропускают через хроматографическую колонку (5x0,5 см), заполненную бациллихин-силохромом, уравновешенную 0,1М ацетатным буфером, рН 4,5. Затем промывают сорбент тем же буфером. Активный фермент элюируют 20% изопропанолом в 1М NaCI, рН . дельная активность фермента в элюате 120 е.а./о.е., очистка в 36 раз. Выход по активности 90%.

Пример 6 , Вьщелен 1е двух протеиназ из высушенного экстракта культуральной жидкости баз1адального гриба Russula decdorans Fr-0456 с помощью бациллкхин-силохрома и грамицидин-С-силохрома.

Экстракт, содержащий фермент с удельной активностью 180 е.а./о.е., пропускают через хроматографическую колонку (25x1,5 см) с бациллихинсилохромом, уравиовеи.1екную 0,1М ацетатным буфером, рН 4,5. Собирают прошедший через сорбент раствор,который содержит протекназу 1. Удельная активность раствора 2,6 е.а./о.е. Колонку промывают исходным буфером. Протеиназу 11, сорбированную на коонке элюируют изопропанолом в 1М NaCI, рН 4,5. Удельная активность фермента в элюате 380 е.а./о.е. Выход по активности 88%, очистка в 2,4 раза.

Раствор, содержаадий протеиназу 1, не сорбировавшуюся на 6ациллихин силохроме, пропускают через хроматографическую колонку (18x1 см) с грамицидин-С-силохромом.

Для получения сорбента используют 50 г аминосилохь ома (50 мкмоль аминогрупп на 1 г) в 0,1М ЫаИСОэ, рН 10, 162 мг п бензохинона в 30 мл абсоютного диметилформамида и 2,1 г грамицидина С, .Условия синтеза те , что в примерах 1,2

Колонку с сорбированной протеиназой 1 промывают 0, 1М ацетатньп- буфером, рН 4,5, активный д)ермент элюируют 20%-ным изопропанолом в 1 М Wace, рН 4,5. Удельная активность фермента в элюате 370 е.,ае/о.е,, очистка в 3,7 раза, выход по активности 60%.

Пример 7. Очистка 05-химотрипсина на фенилборонат-силохроме. Д/ш синтеза сорбента использова65 -ПИ аминосилохром (415 мкмоль аминогрупп на 1 г), янтарный ангидрид и хлоргидрат п- (СО-аминометил) фенилборной кислоты.

3 г аминосилохрома обрс1батывают в течение 20 мин при 20°С раствором 1 г янтарного ангидрида в 9 мл диметилформамида. Избыток ангидрида удаляют промывкой 50 мл диметилфор мамида и водой. К 3 г полученного сукцинилсилохрома прибавляют 333 мг хлоргидрата п- (w-аминометил)фенилборной кислоты в 15 мл. воды. Затем при рН 5 добавляют 3 г водорастворимого карбодиимида, Смесь выдерживают 1 ч при при осторожном периодическом перемешивании о Сорбент отфильтровывают и промывают большим количеством воды, а перед опытом всеми элюирующими растворами. Полученный фенилборонат-силохром содержит 215 мкмолей лиганда на 1 г сухого сорбента (или 100 мкмолей на 1 мл влажного сорбента). На колонку с 2 мл фенилборонат-силохрома наносят раствор 10 мг 06 -химотрипсина в 10 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,5о Удельная активность раствор 0,025 е,а,/мг. Затем сорбент промывают 50 мл исходного буфера 1М NaC в том же буфере, 0,5 М глицерином в том же буфере, фосфатным буфером, рН 9, и элюируют белок 0,5 М пентаэритритом в 0,05 М фосфатном буфере рН9. Получают 5,9 мг белка с удельной активностью 0,053 е.а„/мг. Выход по активности 100%, очистка в 1,7 раза.

П- р и М е р 8. Очистка субтилизина А-50 на фенилборонат-силохроме.

На. колонку с 4 мл фенилборонатсилохрома, полученного по методу, приведенному в примере 7, и уравновешенного 0,05 М фосфатным буфером, рН 7,5, наносят 40 мл культуральной жидкости Вас, Subtilis А-50 с рН 7, с удельной активностью 0,08 е,а./мг по гидролизу Z-Ala-Ala-Leu-pNA, Колонку последовательно промывают 0,05 М фосфатным буфером, рН 7,5, 1М NaCI в том же буфере, 0,5М глицерином в том же буфере, 0,05М фосфатным буфером, рН 9, Активный бело элюируют О,5М пентаэритритом в 0,05М фосфатном буфере, рН 9. Посл обессоливания и лиофилизации получают 2,26 мг белка с удельной активностью 1,08 е.а./мг, выход 80%, очистка в 13,7 раз.

Пример 9, Синтез фенилборо нат-силохрома с применением в качестве конденсирующего агента гекса(метилендиизоцианата,

К 1 г аминосилохрома (340 мкмоль NH -rpynn) прилийают избыток гексаметилендиизоцианата и оставляют при комнатной температуре на 15 мин, затем промывают аминосилохромдиметилфор.мамидом и водой. Получают сорбентi содержащий 300 мкмоль изоцианатных групп на 1 г носителя. К 1 г такого сорбента приливают раствор 200 мг п- (aJ-аминометил) фенилборной кислоты 5 в 5 мл диметилформамида, оставляют на 20 мин при комнатной температуре, затем избыток реактивов отмывают диметилформамидом и водой. Получают фенилборонат-силохром с содержанием

0 лиганда 150 мкмоль/г.

Пример- 10. Очистка пепсина на. грамицидин-С-силохроме.

К раствору 25 мг препарата свиного пепсина (производства Московского

5 мясокомбината) в 10 мл 0,05М универсального буфера, рН 1,8, добавляют 200 мг грамицидин-С-силохрома, перемешивают 20 мин, раствор декантируют, промывают сорбент пять раз по 5 мл

Q универсального буфера, рН 1,8, и элюируют пепсин дважды по 5 мл 1М хлористого натрия в 0,05М универсальном буфере, рН 1,8, содержащем 25% изопропанола. Выход по активности 30%,

5 очистка в 10 раз.

Пример 11. Очистка-субтилизина BPN на бацитрацин-силохроме.

К раствору 25 мг субтилизина BPN (Серва) в 10 мл универсального буфера, рН 6,0, прибавляют 200 мг

бацитра1/ин-силохрома, перемешивают 20 мин, промывают сорбент пять раз по 5 мл 0,05М универсального буфера, рЫ 6,0, и элюируют субтилизин дважды по 5 мл 1М хлористого натрия в

5 0,05М универсальном буфере, рН 6,0, содержащем 25% изопропанола. С выходом 45% получают субтилиаин BPN, обладающий активностью по Z-AIa-AIa-Leu-pNA, 1,5 е.а./мг,. очистка в

0 1,5 раза.

Пример 12. Очистка субтилизина 72 на бацитрацин-силохроме.

На колонку с 10 мл бацитрацин-сиг лохрома, уравновешенную 50 М трис-буфером, рН 8,5, наносят раствор 2 г промышленного препарата субтилизина 72 (Протосубтилин ГЗх) с удельной активностью 0,166 е.а./мг. Колонку промывают 50 мМ трис-буфером, рН 8,5, затем 1М хлористым натрием в том же буфере. Активный фермент элюируют 1М хлористым натрием в 50 мМ трисбуфере, рН 8,5, содержащем 20% изопропанола. В результате получают 5 56 мг препарата с удельной активностью 7,7 е.а./мг. Выход по активности 130%, очистка в 40 раз.

Пример 13, Очистка щелочной 0 сериновой протеазы Вас. Lichenifor- mis на фенилборонат-силохроме.

На колонку с 4 мл фенилборонатсилохрома (200 мкмоль лиганда на 1 г(сорбента), уравновешенную 0,5М гли.5 церином в 0,05М фосфатном буфере.

11 94242712

рН 6,0, наносят раствор 10 мг про-Протеазу элюируют 0,5М пентаэритримышленного препарата сериновой про-том в 0,05М фосфатном буфере, рН 9.5.

теазы Вас. licheniformis в 5 мл тогоВыход по активности 150%, очистка

же буфера. Колонку промывают тем жев Ь,6 раз, полученный препарат имеет

буфером, 1М хлористым натрием вудельную активность, определяемум. по

0,05М фосфатном буфере, рН 6,0, и5 гидролизу Z-AIa-AIa-Le i-pNA,

0,05М фосфатным буфером, рН 9,5.18 е.а./мг.

liCnOCOB ОЧИСТКИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ путем биоспецифической сорбции ферментсодержащих растворов при рН, большем или равном 1,8, на нерастворимом носителе, который предварительно вводят во взаимодействие с раствором к нденсируюсцего агента и лигандом, с последующей десорбцией сорбированных ферментов солевыми буферами или солевыми растворами органических растворителей, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности процесса за счет увеличения выхода ферментов высокой степени чистоты и активности, а также удешевления и упрощения процесса, в качестве носителя используют аминопроизводное кремнеземсодержащего материала, а процесс ведут при рН 1,8-9,5 в зависимости от рН-оптимума фермента, 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве носителя используют аминосилохром. 3.Способ по п. 1, отлича ющ и и с я тем, что в качестве кон{денсирующего агента используют (зохинон, или карбодиимид, или гексаметилендиизоцианат. 4.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве лиганда используют п-(со-аминометил) производное фенилборной кислоты или антибиоэик-полйпептид. 5.Способ по п. 4, отличающийся тем, что, в качестве антибиотика используют бацитрацин, или бациллихин, или грамицидин С. 6.Способ по пп. 1-5, отличающийся тем, что при очистке карбоксильных протеиназ в качестS ве лиганда используют антибиотик Л полипептид, а процесс ведут при рН 1,8-5,0. 7.Способ по пп. 1-5, отличающийся тем, что при очистке сериновых протеиназ в качестве лиганда используют антибиотик - поли| пептид, а процесс ведут при рН 6,0|8,5. 8.Способ по пп. 1-4, о т л ичающийс я тем, что при очистке сериновых протеиназ в качестве лиганда используют п- (со-аминометил) фенилборную кислоту, а процесс ведут при рН 6,0-9,5. 9.Способ по п. 8, отличающийся тем, что процесс осуществляют при рН 7-8. 10.Способ по пп. 1-4 и 7-9, отличающийся тем, что сорбцию сериновых протеиназ ведут в присутствии глицерина, а десорбцию - в присутствии растворов многоатомных спиртов, например пентаэритрита.