Способ получения холестериноксидазы Советский патент 1983 года по МПК C12N9/08 

Изобретение относится к микроби логической промышленности и касает ся способа получения холестеринокс дазы из микроорганизмов. Известны различные виды микроор ганизмов - продуцентов холестерин-оксидазы и способы получения этого фермента. Наиболее близким по техническо сущности и достигаемому результату к предлагаемому является способ по чения холестериноксидазы, предусма ривающий культивирование продуциру щего микроорганизма, в том числе, и рода Streptomycetaceae, на питател ной среде, содержащей дрожжевой экстракт, минеральные соли , MgSO47H2O, FeSO4 VHgO И воду, с п ледующим выделением фермента из культуральной жидкости и/или из клеток Щ. Недостаток такого способа состо в необходимости добавления индукто ров для повышения активности фермента, которая невелика и достигает небольшой величины порядка 100 и/л. Цель изобретения - удешевление процесса. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения холестериноксидазы, предусматривающему культивирование продуцирующего микроорганизма, в том числе и рода Streptomycetaceae, на питательной среде, содержащей дрож жевой экстракт, минеральные соли К2НРО4, , FeSO ТНаО и ВОЛУ, с последующим выделением фермента из культуральной жидкости и/или из клеток, в качестве продуцирующего микроорганизма из рода Streptoraycetaceae используют Strep myces grlseofuscus DSM 40191 или Streptomyces higroscopicus DSM 407 или Streptomyces acidomyceticus DSM 40798 и/или Arthrobacter paraf neus DSM 312. Кроме того, культивирование ведут на среде, в состав которой дополнительно вводят растворимый крахмал, пептон и минеральные соли CaCOj, КНОз ,NaCl при следующем соотнсяаении компонентов, вес.%: Растворимый крахмал Пептон Дрожжеврй экстракт 1-3 0,5-3 0,2-2 KjHPOi 0,5-3 -- -- 0,2-2 Fes647Н О 0,01-0,05 Остальное Вода Сущность изобретения состоит в использовании штаммов продуцентов холестериноксидазы, способных продуцировать фермент без индуктора на сбалансированной по ростовым факторам питательной среде подобранного состава. Ниже представлены характеристики используемых согласно изобретению штаммов микроорганизмов. Streptomyces griseofuscus ВМТи 1616, DSM 40191, АТСС 23916 Общая характеристика: грамположительный, аэробный организм, который образует воздушный мицелий. Окраска: колонии во.здушного мицелия при росте на дрожжево-солодовом агаре, агаре из овсяных хлопьев, на крахмальном агаре с минеральными солями и на глицерин-аспарагиновом агаре могут быть серии красных или серых тонов (корице-коричнево-серый.) На задней стороне колоний не видно никаких специфических пигментов. Растворимые пигменты: никакого образования меланоидных пигментов в пептон-дрожжевсм агаре с железом, тирозиновсм агаре или триптон-дрожжевом питательном растворе, а также образования пигментов в дрожжевосолодовом агаре, агаре из овсяных хлопьев, крахмальном агаре с минеральными солями или глицерин-аспарагиновом агаре нет. Морфология цепи спор: спиральные участки. Зрелые, узкоспиральные цепи спор содержат 10-50 спор, поверхность спор гладкая. Использование С-источников. Использование D-глюкозы, L-арабинозы, D-ксилозы, D-маннита и D-фруктоэы. Никакого роста или скудный рост на сахарозе, инозите, рамнозе, рафинозе и лактозе. Образцы алифатических жирных кислот: для представителей семейства Streptomycetaceae характерно преимущественное наличие изо/антеизо-С-15 и изо/антеизо-С-17,Стенка клетки срдержит типичную для Streptorayces 1Л-диаминопимелиновую кислоту.DL-Itoaминoпимeлиновая или oкcи-DIJ-диaминoпимeлинoвaя, кислота отсутствует. Streptomyces nigroscopicus BMTU2093, DSM 40771,АТСС 10976 Общая характеристика: грамположительный, аэробный организм, который образует воздушный мицелий. Окраска: колонии воздушного мицелия при росте на дрожжево-солодово агаре, агаре из овсяных хлопьев и крахмальном агаре с минеральными солями могут быть серии красных и серых тонов (корице-коричнево-серый. На задней стороне колоний не

видно никаких специфических пигментов.

Растворимые пигменты: никакого образования меланоидных пигментов в пептон-дрожжевом агаре, а также образования пигмента в дрожжево-солодовом агаре, крахмальном агаре с минеральными солями и агаре из овсяных хловьев нет.

Морфология цепей спор: спиральны участки. Цепи спор в узких, х замкнуты х спиралях, часто на ножках, состоят из 10-50 спор, поверхность спор гладкая.

Использование С-источников.

Использование D-глюкозы, П-ксилозы, В фруктозы и D-маннита. Никакого роста или очень скудный рост на L-арабинозе, рамнозе, сахарозе, рафинозе, инозите и лактозе.

Образцы алифатических кислот: для представителей семейства Streptmycetaceae характерно преимущественное наличие изо/антеизо-С-15 и изо/антеизо-С-17-алифатических кислот .

Стенка клетки содержит типичную для Streptomyces LL-диаминопимелиновую кислоту. DL-Диаминопимелиновая или окси-ОЬ-диаминопимелиновая кислота отсутствует.

Streptomyce,s acidomyceticus

ВМТи 1.873, DSM 40798,

АТСС 11611

Общая характеристика: грамположительный, аэр.обный организм, который образует воздушный мицелий.

Окраска: колонии воздушного мицелия при росте на дрожжево-солодовом агаре, агаре из овсяных хлопьев и крахмальном агаре с минеральными солями могут быть серии красных (серых) тонов (розовый, корйце-корич невый). На задней стороне колоний при росте на дрожжево-солодовом агаре заметен пигмент желто-коричневого цвета, на агаре из овсяных хлопьев - красно-коричневого цвета и йа крахмальном агаре с минеральными солями - черного цвета.

Растворимые пигменты: образование меланоидных пигментов в пептондрожжевом агаре с железом. Другие пигменты типа упомянутых не образуются.

Морфология цепей спор: участки Retinaculiaperti со многими прямогибкими цепями спор при росте на дрожжево-солодовом агаре. На агаре из овсяных хлопьев и крахмальнс агаре с минеральными солями - образование крючков, петель и коротких нерегулярных спиралей. Поверхность спор гладкая.

Использование С-источников.

Использование D-глюкозы., L-apaбинозы, D-фруктозы и сахарозы. Никакого роста на рамнозе, лактозе, рафинозе, D-манните и инозите.

Для представителей семейства Streptomycetaceae характерны изо/антёизо-С-15 и изо/антеизо-С-17-образцы алифатических кислот.

Стенка клетки содержит типичную для Streptomyces LL-диаминопимелиновую кислоту. DL-Диаминопимелиновая кислота илиoкcи-DTJ-диaминoпимелиновая кислота отсутствуют.

Arthrobacter paraffineus . ВМТи 501, DSM 312.

Морфология: от коротких до средней длины, коринеобразные столбики

с типичным снаппинг -делением. Нет никакого явно выраженного цикла развития, клетки на всех фазах развития столбикообразные. Клетки грамположительны и неподвижны. Никакого

образования спор. Колонии на HD-araре бело-кремовой окраски и блестящие } нет никакого образования пигментов.

Физиологические свойства.

Отнемение к кислороду - ярко выраженное аэробноеf образования кислот из глюкозы и лактозы не происходит; катализата образуется; оксидаза не определяется} восстановление нитрата - положительное} расщепление крахмала, желатины и казеина отрицательное; расщепление трибутурина - слабо положительное; уреаза образуется; образование индола и HjS - отрицательное; использование

цитрата - положительное; солевая толерантность - расчет в случае 5% NaCl, никакого роста при 10% NaCl.

Пептидоглика« стенки клетки содержит мезо-диамино-пимелиновую кйслоту.

Пример. Streptomyces grlseofuscus DSM 40191 ( равноценен АТСС 23916 и iFO 12870) культивируют в среде следующего состава,

/ Растворимый

крахмал.20

Дрожжевой экстракт

(Дифко)4

Пептон (мясной)5

Карбонат кальция3

Нитрат калия1

Дикалий-фосфат К2НРО 0,5

MgSO47H,zO1,03

Хлористый натрийО,5

FeSO47H2O.0,02

Штамм культивируют 2 дня в 10 мл среды в колбе Эрлеимейера на 100 мл, затем переносят в 40 мл такой же

среда в колбе Эрленмейера (З дня), отбирают пробу и проверяют активность холестерином дозы в отделенном культуральном растворе и в экс,тракте-сырце. Экстракт-сырец получают центрифугировании 5 мл культуРсшьного раствора, промыванием биомассы 0,05 М фосфатным буфером рН 7, торным суспендированием в 5 мл такого же буфера и распределением посредством добавки О,2 мл 10%-ного раствора продукта Тритон-Х-100.После 10 мин выдержки при комнатной температуре центрифугируют и получают отделившийся культуральный раствор в виде экстрактасырца.

Для проведения определения активности измеряют образование холестенона посредством прироста погасания (экстринкции) при 240 мм, при рН 7, в 0,5 моль/л фосфатном буфере. .Чля контроля каждый раз определяют холостую величину без добавления холестена.

Были получены следующие значения U /л:

Общее - культурального раствора 5741

Экстракта-сырца,

полученного из

этого раствора 1118

Отделенного культурального раствора 4623

П р и м е р 2. Повторяют способ по примеру 1 с применением Streptomyces higroscopicus DSM 4077 (соответствует АТСС 10976).

Определения проводят через 3 и 4 дня IB течение культивирования.

Значения активности приведены в таблице..

В случае культивирования в присутствии 2% холестерина в качестве

индуктора прирост активности составляет величину меньше половины.

П р и м е р 3. Повторяют способ по примеру 1 с применением Streptomyces acidomyceticus DSM 40789 ((соответствует АТСС 11611 и iFO 3125.

Результаты при длительности культивирования 3 и 4 дня показаны в таблице.

При проведении культивирования при наличии 2% холестерина в качестт ве индуктора прирост активности увеличивается на 5-0%.

П р и м. е р 4. .Повторяют способ по примеру 1 с применр 1ием Arthrobacten paraffineus DS 312 (соответствует АТСС 15591), однако при условии добавления к среде 3% холестерина в виде суспензии в дрожжевом экстракте (суммарное количество 10 г/л). После четырехдневного культивирования в экстракте-сырце обнаружено значение У/л 4470. В культуральном растворе после отделения также установлена значительная активность.

Применение- изобретения позволяет существенно удешевить способ произ врдства -за счет достижения более высоких значений активности холестериноксидазы. При этом особое преимущество заключается в возможности исключения индуктора холестериноксидазы, что приводит не только к дополнительному удешевлению способа, но также к значительному повышению воспроизводимости способа.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНОКСИДАЗЫ, предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма, в том числе и рода Streptomycetaceae, на питательной среде, содержащей дрожжевой экстракт, N«Heральные соли , MgSO 71120, FeSO47HjO и воду, с последуюьим выделением фермента из культуральной жидкости и/или из клеток, о т л и чающийся тем, что, с целью удешевления процесса, в качестве продуцирующего лдакроорганизма из рода StrepfcOTnycetaceae используют Streptcmq ces griseofuscus DSM 40191 или StreptOTayces higroscopicus DSM 40771 иЯи Streptoroyces acidonyceti cus ШМ 40798 и/или Arthrobacter paraffineus DSM 312. 2. Способ no П. 1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что культивирование ведут на среде, в состав которой дополнительно вводят растворилслй крахмал, пептон и минеральные соли СаСО, ШОз,НаС1 при следуюЕдем соотношении компонентов, вес.%; Растворимый i CO крахмал10-30 Пептон.2-10 Дрожжевой экстракт 2-10 ,5-3 КлНРО 0,2-2 t SO47HAO0,5-3 Had0,2-2 FeS047H,iO0,01-0,05 BonaОстальное ro o: да СЛ OS