Способ получения антибиотика Советский патент 1985 года по МПК C12P1/06 

:л

Nd :о

Изобретение относится к микробиологической промьгашенности и касается получения нового кислотного полиэфирного антибиотика.

Аналогов в патентной и научнотехнической литературе не обнаружено, енз н СН, штамм Streptomyces halstedii АТСС 31812 культивируют в питательной сре де, содержащей источники углерода и азота и минеральные соли, в глубинны аэробньк условиях с последующим вьще лением целевого продукта из культуральной жидкости и при необходимости переводом его в катионную соль. Используемый для осуществления способа микроорганизм Streptomyces halstedii вьщелен из образца почвы в Японии, Депонирован в American Туре Culture collection под номером 31812 Штамм Streptomyces halstedii АТСС 31812 характеризуется следующими признаками, Культурально-морфологические приз наки. Агар дрожжевого экстракта - солодового экстракта - хороший рост, цвет от кремового до светло-желтоватого, умеренно повышенньй, гладкий, загрубленяый до морщин, без воздушного мицелия; обратная сторона такая же, как поверхность; растворимьш пиг мент отсутствует, Агар овсяной муки - умеренный рос серьй до коричнево-серого, от слабо го до слегка повьшенного, гладкий с небольшими белыми пятньшками; слабый воздушный мицелий, белый до светло-саронатого; обратная сторона такая же, как поверхность; растморимый пигмент светло-желтоватый. Неорганические соли - крахмаловый агар - умеренный рост, желтоват коричневый до коричневого, жидкий, гладкий, без воздушного мицелияг; обратная сторона такая же, как поверхно.сть; растворимый пигмент отсу ствует, Глицерин - аспарагиновый агар рост от умеренного до слабого, туск ло-бельй, жидкий, гладкий с небольЦель изобретения - создание способа получения антибиотика.

Цель достигается тем, что согласно способу получения антибиотика формулышими белыми пятнами; слабьй воздушный мицелий; белый; обратная сторона такая же, как поверхность; без растворимого пигмента, Тирозиновый агар Гордона и Смита рост от слабого до умеренного, бесцветный до кремового, жидкий, гладкий, без воздушного мицелия; обратная сторона такая же, как поверхность; без растворимого пигмента, Чапек-сахарозный агар - слабый рост, бесцветный до тускло-белого, жидкий, гладкий, с небольшими белыми пятнами воздушного мицелия; обратная сторона такая же, как поверхность; без растворимого пигмента, Глюкозо-аспарагиновый агар умеренный рост, желтовато-серый до лавандово-серогр, жидкий, гладкий, но слегка сморщенный вблизи края; воздушный мицелий светло-серый; обратная сторона такая же, как поверхность; растворимый пигмент светло-желтый , Агар с кальциевой солью яблочной кислоты - слабый рост, бесцветный с тускло-белым краем, затопленный, гладкий с небольшими пятнами сероватого воздушного мицелия; обратная сторона такая же, как поверхность; без растворимого пигмента. Казеиновый агар - умеренный рост, светло-коричневый, жидкий, гладкий до слегка загрубленного, без воздушного мицелия; обратная с:торона такая же, как поверхность; без растворимого пигмента. Агар Баннета - хороший рост, коричневый, повышенный, морщинистый, без воздушного мицелия; обратная сторона такая же, как поверхность; растворимьп пигмент светло-желтоватый. 3 Агар Эмерсона - рост от умеренно до хорошего, светло-желтовато-корнчневый до зеленовато-серого, жидкий до повьпиенного, гладкий до слегка загрубленного или возникающий как мембранные чаши, которые нерегулярно сморщены, без воздушного мицелия, обратная сторона такая же, как поверхность; без растворимого пигмента Питательный агар - рост от слабого до умеренного, светло-желтоватьй жидкий, гладкий, без воздушного мице лия; обратная сторона такая же, как поверхность; нет растворимого пигмен та. Желатиновый агар - рост умеренный светло-желтоватый, жидкий, гладкий, без воздушного мицелия; обратная сторона такая же, как поверхность; без растворимого пигмента. Крахмаловый агар - хороший рост, кремовый, светло-желтоватьй до светло-желтовато-коричневого, жидкий до несколько повьш1енного, гладкий, но сморщенньш по направлению к краю, без ВОЗДУШНОГО мицелия; обратная сторона такая же, как поверхность; без растворимого пигмента. Картофеле-морковный агар - умерен ньш рост, кремовьш (2 са) с Сероватым до темно-серого краем, жидкий, гладкий, воздушный мицелий от серого до темно-серого; обратная сторона такая же, как поверхность; растворимьй пигмент отсутствует. Агар водной вытяжки - плохой рост бесцветный до мутно-белого, жидкий, гладкий, с небольшими белыми пятнами воздушного мицелия, обратная сторона такая же, как поверхность; растворимый пигмент отсутствует. Физико-бйологаческие свойства. Меланин не образуется. Сероводород не образует. Желатин разжижает, Крахмал гидролизует. Нитрат восстана ливает до нитрита, Ограниченньй рост на целлюлозе Иенсена. Отсутствует рост на целлюлозе Левина и Шоен лайна. Нет разложения на обеих целлюлозных средах. Молоко не коагулирует, не пептони зирует. Не усваивает казеин, кальциевую соль яблочной кислоты и тирозин. На среде Нономуры использует глюкозу, арабинозу, ксилозу, плохо усва ивает рафинозу; не успевает сахарозу 194 инозитол, маннитол, фруктозу и рамноНа среде 1SP № 9 импользует глюкозу, арабинозу, ксилозу, и сахарозу, не усваивает фруктозу, инозитол, маннитол, раффинозу и рамнозу. При культивировании на картофелеморковном агаре в течение 15 сут масса спор серого цвета, цепочки спор прямые, искривленные, нерегулярно изогнутые или волнистые, изредка крючковатые, от 10 до 3Q спор в каждой цепочке, редко менее 10; скосы овальные, от эллиптических до стержнеобразных, 1-1,8x0,8-0,9 мкм, гладкие, . Хороший рост при 21-28 С, может расти и при ЗУ-ДЗ С, . Пример 1, Готовят стерильную среду следующего состава, г/л воды: церелоза 10; крахмал 20; дрожжевой экстракт 5; № Z УТТ (казеин ферментативного переваривания) 5; дикалийгидрофосфат 0,5; мясная мука 5; хлорид кобальта 0,002; карбонат кальция 4; рН среды 7,2-7,1. Культуру со скошенного агара переносят в ряд колб объемом 300 мл, каждая из которых содержит по 40 мл стерильной среды указанного состава, встряхивают на роторной качалке при 28-36°С в течение 3-4 сут. Аликвоту растущей культуры, достаточную для обеспечения 2 об,% ино кулята, переносят в 4-литровые ферментеры, каждый из которых содержит 2 л стерильной среды следующего состава, г/л воды: перелоза 10; № Z амин А (казеин ферментативно переваренный 5; крахмал 20; дрожжевой экстракт 5; карбонат кальция 1; хлорид кобальта 0,002, Ферментацию ведут при и перемешивании со скоростью 1700 об/мин и степени аэрирования IV об, воздуxa/V об,.среды/мин, в течение 3-5 сут, Культуральную жидкость фильтруют при нейтральном рН, фильтрат экстрагируют метилизобутилкетоном или н-бутанолом. Органическую фазу отделяют .ют водной фазы и фильтруют для удаления суспендированного материала. Твердое вещество на фильтрате суспенируют в метаноле, отфильтровывают, етанол вьтаривают и остаток экстрагируют тем же растворителем. Экстракты объединяют и выпаривают в закууе, получают вязкое масло. Его суспендируют в гептане, перемешивают с силикагелем и фльтруют. Остаток на фильтре повторно промывают гептаном, продукт ступенчато элюируют чистым хлороформом, смесью хлороформа и этилацетата н чистым этилацетатом. После проведения тонкослойной хроматографии и биоанализа фракций активные фракции объединяют выпаривают в вакууме и остаток повторно хроматографируют для получения антибиотика 53607 в виде твердого вещества. Инфракрасный спектр (таблетка с КВг), мкм: 2,95; 3,42j 6,00; 6,37; 6,85; 7,1А; 7,30;7,65; 7,90; 8,1,9,0 9,15; 9,67; 10,0; 10,18; 10,53; 11,1 11,40; 11,75; 13,25. Антибиотик раст ворим в хлороформе, этилацетате, метиловом спирте и метилизобутилкетоне; не растворим в воде. Пример 2. Готовят инокулят по примеру 1, но используют 700 мл среды в каждой колбе, инокулят ферментируют во встряхиваемой колбе при в течение 3-А сут, смешивают в двух бутылях с боковыми отводами. Ферментер емкостью 6435 л, содерж щий 4542 л стерильной среды, указанн ниже, инокулируют 6 л (0,1%) указанн инокулянта. Ферментационная среда, г/л: церелоза 1,0; казеин 5,0; крахмал 5,0; карбонат кальция 3,0; хлорид кобальта 0,002; жидкость после замачивания кукурузы 5,0 мл; вода до 1 л рн 6,9-7,0. Ферментацию ведут при 28 С при аэрировании и перемешивании со скоростью 1700 об/мин. Через 120 ч ферм тер выгружают. Весь бульон экстрагируют 946 л метилизобутилкетона, слои фаз разделяют в экстракторе Подбельняка и органическую фазу концентрируют в вакууме, получая 30,3 л масла Масло дополнительно концентрируют в вакууме на роторном испарителе. Остаточный сироп Суспендируют в гептане, перемешивают с силикагелем и фильтруют, промывая несколько раз гептаном. Промытый остаток на фильтре обрабатьшают по примеру 1, получа 300 г масла, которое растворяют в небольшом количестве хлороформа, раствор выливают на фильтр (Лэпп), содержащий 3,5 кг силикагеля, и силикагелевый слой последовательно промьгоают порциями по 19 л хлороформ этилацетата и ацетона. Фракции иссле дуют методом тонкослойной хроматографии. Найдено, что продукт почти полностью содержится в этилацетатной фракции. Прочие фракции выбрасывают, этилацетатную фракцию выпаривают досуха в вакууме, получая 150 г концентрата. Концентрат дополнительно очищают хроматографически на колонке 8,0x1000 см, заполненной тем же силикагелем, суспендируя концентрат в этилацетате. Колонку элюируют этилацетатом, отбирая литровые фракции, со скоростью 60 мл/мин. Фракции, содержащие продукт, собирают и выпаривают в вакууме, получая 85 г продукта. Этот продукт пропускают через колонку, содержащую 1 кг смолы Сефадекс Эль-Эйч-20, элюируют метанолом со скоростью 25 мл/мин. Отбирают фракции объемом 300 мл. Объединяют фракции, содержащие продукт, и выпаривают растворитель, получая 30 г твердого вещества, которое растворяют в 500 мл хлороформа, раствор промывают равным объемом 5%-ного натрийдигидрофосфатного буфера, который доводят до рН 4,5 добавлением 85%-ной фосфорной кислоты. Отделяют органический слой, промывают его 500 мл 5%-ного динатрийгидрофосфатного буфера, который доведен до рН 9,0 добавлением 1 н. раствора гидроокиси натрия. Затем экстракт высушивают над безводным сульфатом натрия и выпаривают досуха в вакууме. Твердый остаток растворяют в ацетоне и дают выкристаллизоваться в холодильнике. Кристаллы собирают путем фильтрации и высушивают при глубоком вакууме при комнатной температуре, получая 14 г натриевой соли соединения антибиотика 53607 с Т.Ш1. 199-204°С. Оптическое вращение: (o() (, в хлороформе), (с )д437 (, в метаноле). УФ-с пек тр: А МО КС 233 нм (в метаноле, Е,7 212). Инфракрасный спектр (таблетка с КВг), мкм: 2,95; 3,42; б ,00; 6,37; 6,85; 7,14; 7,30; 7,65; 7,90; 8,10; 9,05; 9,15; 9,67; 10,00; 10,18; 10,53; 11,15; И,40; 11,75; 13,25. Элементный анализ: С 57,54; Н7,74, N 0,0. Применяя буферные растворы ,, (рН 4,5) и КгНР04, доведенный о рН 9,0 I н. раствором гидроокиси

калия, по указанной методике аналогично получают калиевую соль соединения антибиотика 53607 (аналогично получают аммониевую соль, используя в указанной методике дигидрофосфат аммония и диаммоний гидрофосфат).

Часть полученной натриевой соли соединения антибиотика 53607 растворяют в этилацетате, добавляют воду и доводят водную фазу до рН 4,5, под кисляя ее фосфорной кислотой Отделяют органический слой, высушивают сульфатом натрия и выпаривают в вакууме, получая соединение 53607 в виде свободной кислоты с т.пл. 84-95 С.

Данные элементного анализа получают для образца, высушенного в течение ночи в глубоком вакууме при комнатной температуре: С 64,69; Н 8,91; N 0,0.

Найдено., что эта кислота не растворяется в воде; растворима в хлороформе, этилацетате, метаноле и метилизобутилкетоне

(«i)jj+74,5 (, в хлороформе),.

(oi)jj+49,7 (, в метаноле).

УФ-спектр: j,j,j 233 нм (в метаноле, Е;;; 198).

ИК-спектр (таблетка с КВг), мкм: 2,95; 3,45; 6,00; 6,85; 7,28; 8,13; 9,05; 9,67; 10,20; 10,55; 11,15; 11,48.

Бариевую соль получают встряхиванием 2,0 г свободной кислоты, раст воренной в 80 мл этилацетата, с равнь1м объемом .воды, содержащей 2,4 г октагидрата гидроокиси бария. Разделяют слои, промывают органическую фазу свежим раствором октагидрата гидроокиси бария, высушивают сульфатом натрия и выпаривают в вакууме, получая соль соединения антибиотика 53607.

Кальциевую соль /готовят по указанной методике, но используя гидроокиси кальция вместо октагидрата гидроокиси бария.

Пример 4. По методике примера 1 используют 4%-ный раствор инокулята в 4-литровых ферменторах, каждый из которых содержит 2 л следующей стерильной среды, г/л:церелоза 10; кукурузный крахмал 10} соевая пудра 10; карбонат кальция 1; ферментируемое твердое вещество кукурузы 5; хлористьй натрий 5; рН 7,0,

Ферментацию проводят в течение 2 сут при 36°С и перемешивании со скоростью 1700 об/мин при продувке воздухом со скоростью 2 об/1 об бульона/ /мин. Весь бульон экстрагируют хлороформом и обрабатывают tio примеру 1, получая соединение антибиотика 53607 в виде смеси его натриевой, калиевой и кальциевой солей.

. Когда указанную методику повторяют, но вместо церелозы используют в ферментационной среде глицерин, а также рыбную муку или муку из семян хлопка вместо ферментизируемого твердого вещества кукурузы и проводят ферментацию при рН 8,0, в течение 6 сут, то получают практически те же результаты.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА формулы он И СН, заключающийсй в том, что штамм Streptorayces halstedii АТСС 31812 культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода и азота и минеральные соли, в глубинных аэробных условиях с последующим вьщелением целевого продукта из культуральной жидкости и при необходимости переводом его в катионную соль. (Л с