Способ определения активности фенолоксидаз Советский патент 1983 года по МПК C12Q1/26 

(Л С

I. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВЬЮСТИ ФЕЖ)ЛОКСИДАЗ, включаюЩЙ1 обработку пробы фенольвым субстратом и измерение люминесценции реакционней смеси, отличающийся тем, что, с целью расширения класса определяемых фенолокспдаз, обработку пробы субстратом ведут в присутствии суспенаии светящихся бактерий Б&иесКеа . 2. Способ по п. t, отличающий с я тем, что, обработку пробы субстратом вeдJт при рН 6-8.

IND го Изобретение относится к аналитической х-имии, в частности к способам опр делеш1я активности фенолоксидазных фер ментов, и может быть использовано в лабораторной практике, медишгае, пищевой промышленности. Известен способ определения активности фенолоксидаз путем обработки исследуемой пробы субстратом и спектрофотометр1фования. Активность выражает ся в увел}гчении поглошешш при длинах волк, соответствующих проду} :там окисле ния fl. Недостатком этого способа являются низкая -чувствительность и невозможност намерения в мутных растворах. Наиболее близким по технической с ЩЕости к изобретеЕшю является спосо определения активности полифенолоксида оы путем обработки исследуемой пробы фено, субстратом - экскулетином и измерения .7тюм.инесценции. Обьтчно обработку пробы ведут при рН 6,8-8,0, Способ основан на использовагаш люмине цир 1ошего су&страта-эскулвтина и спект его птюминесценции. Активность при этом характеризуется величиной снижения интенсивности свечегош при 465-48О им в интервале 5-10 ка-гк при воздействии ,1 мт- (Ьерыентного препарата 1едостатком известного способа является то, что он пригоден для определ летю только одного фермента, Ие.ггь изобретения - расширение класс оп1)епеляемых фенолоксидаз. Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения активHOCTii фенолоксидаз, включающему обработку ана;изируемой пробы фенольным субстратом и измерение люмютесценции реакционной смеси обработку пробы с -бстратом ведут в присутствии суспензгог светящихся бактерий BBi eckeO horveyi. Кроме того, обработку пробы субстр том обьр-iHo ведут при рН 6-8, Способ осуществляется следующим об разом, В суспензию светящихся бактерий 5епес1чеа )1 вводят исследуемую фенолоксидазу (У -дифенолоксидазу или о дифенолоксидазу) и ее субстрат ..Y: - ИЛИ о-дифенол), Через 2-3 с пос ле введения по щкале гальванометра М™95, соедине ге:ого с фотоэлектронным у шожзГтелем (), регистрируют снкжеш е свечения бактерий за счет янгибирования их хиноидны ди продуктал и ферментативного окисления. Отмечаемое гашение интенсивности свечения служит мерой активности фермента. Интенсивность свече1шя бактерий принимают за ЮО ма. За единицу фенолоксидааной активности принято изменеш1е интенсивности свечения бактерий (в процентах) одш&1 мг белкого препарата за 2-3 с. Короткий период проявления реакшш { 2-3 с) позволяет определять начальную активность фенолоксидаз сохраняющихся в нативном виде, что невозможно при более длительных периодах определения из-за изменения фенолоксидаз под действием образующихся хинонов, что позволяет сделать более строгое заключение о фенолокс}щазной активности различных бешсовых препаратов. Предлагаемый способ позволяет расширить класс определяемых фенолоксидазных ферментов, так как в отличие от известного в качестве субстрата можно использовать не только экскулетин/ но и пирокатехин и гидрохинон, которые являются значительно более универсальными субстратами для окисления значительно большим числом фенолоксидазных препаратов. Способ позволяет также расширить область рН, в которой возможно определение фенолоксидазной активности, что дает возможность уве,гшчить количество определяемых фенолоксидаз за счет ферментов, имеющих максимум активности при рН 6-6,5. По сравнению Гс известным способом определяется интенсивность свечения не самого субстрата, а постоянного биологического объекта, чувствительного к хинону. П р и м е р . В термостатируемую камеру установки, состоящей из и гальванометра М-95, помещают стеклянную кювету с 1 мл суспензии клеток ВеиесКеа iiQryevi концентрации SOOlO клеток/мл и 0,1 мл раствора фенола в фосфатном буфере. В кювету при перемешивании вводят О,1 мл раствора фермента с концентрацией 1 г на ЮОмл буфера. По шкале гальванометра в течеfme 2-3 с после введения ферментафиксируют изменение интенсивности свечения. В табл. 1 дана интенсивность свечеия бактерий в присутствии фенолов и посе введения фермента. В табл. 2 показана а1 :тивность фенолоксидаз ( Л ма за 2-3 с I мг фермента)

310272О84

при различных исходных концентрацияхТаким образом, предлагаемый способ

фенола.позволяет расширить класс определяемых

В табл. 3 дана активность фенолоксидаз фенолоксидаз, повысить экспрессность при различных рН { л ма за 2-3 с 1 мгопределения (так как, время определеюш

фермента), концентрация фенола 1 .5 уменьшается с 5-10 мин до 2-3 с).

Таблица I