Способ получения фракции иридоидов,обладающей способностью повышать физическую работоспособность Советский патент 1983 года по МПК A61K35/78 

ю

00 00 00

ел Изобретение относится к получени биологически активных природных сое динений, конкретно к вьщелению из растения коровяк джунгарский (Verba scum songaricum Schrenk семейства норичниковых) фракции иридоидов (смеси аукубина, б-п-кумароилаукуби на, глюкозы и .сахарозы), обладающе свойством повышать,выносливость организма при стрессе. Указанная фрак ция и способ ее выделения могут най применение в медицине для получения стимуляторов физической деятельности в условиях стресса. Известен способ получения фракци иридоидов посредством экстракции растительного сырья водой или спиртами в присутствии углекислого каль ция (или без него) с последующей очисткой экстрактов от балластных веществ ацетатом свинцаили промыва нием органическими растворителями и хроматографированием на колонках с различными адсорбентами С 3Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ получения фракции иридоидов, заключающийся в том, что растение Verbascmn sinuatum экстрагируют спиртом, экстракт упаривают, промывают бензолом и очищают на-колонке с . активированным углем 2 J. Однако известный способ не обеспе,чива,ет получение фракции иридоидо проявляющей свойство повышать выносливость к стрессу, коровяк джунгарский в качестве сырья для получения иридоидов не используется. Целью изобретения является расширение сырьевой базы. Поставленная цель достигается тем что согласно способу получения фракции иридоидов, обладающей способностью повышать физическую работоспособность , путем экстракции подземной части растения рода Verbascum низшим спиртом с последующим упариванием, промывкой бензолом и очистко на колонке с сорбентом в качестве ра тительного сырья используют коровяк джунгарский (Verbascmn songaricum Schrenk}, который экстрагируют металлом при соотношении сырье:экстрагент 1: (18-21), упаренный экстракт растворяют в воде, промывают последо вательно, бензолом, эфиром, хлороформом, далее экстрагируют этилацетатом при соотношении водная фаза:экстрагент 3:20, упаривают, растворяют в воде, фильтруют чжрез слой окиси алюминия и упаривают. Пример. Воздушно-сухую над земную часть коровяка джунгарского (5 кг) исчерпывающе экстрагируют метанолом. Экстракт упаривают досуха при пониженном давлении. Остаток (600 г густой смолы) растворяют в 600 мл воды, промывают гюследовательно (порциями по 2 л) бензолом, эфиром и хлороформом, затем экстрагируют этилацетатом- (10 раз по 0,5 л). Из объединенного этилацетатного раствора отгоняют при пониженном давлении растворитель, остаток (15 г) растворяют в.100 мл воды, профильтровывают через слой, окиси алюминия (-10 см; 200 г), предварительно промывают водой. Затем окись алюминия промывают 150 мл дистиллированной воды, водные фильтраты объединяют и упаривают при пониженном давлении. Остаток (12,5 г светло-коричневой смолы) при хроматографировании на бумаге (система растворителей н-бутанол - уксусная кислота -.вода 4:1:5, обнаружитель бенвидиновый реагент) проявляется в виде четырех пятен с Rf 0,80; 0,51; 0,28 и О,.25. П р и м е р 2 Определение содержания компонентов фракции иридоидов. Три навески по 0,2 г иридоидных фракций, полученных из трех образцов коровяка джунгарского, растворяют каждую в 0,5 мл воды и растворы наносят на стартовые линии трех листов хро.матографической бумаги марки М, пред варительно промытых метанолом и высушенных. Листы хроматографируют нисходящим способом в вышеприведенной системе растворителей до 50 см пробега подвижной фазы, затем хроматограммй высушивают в токе воздуха, от краев отрезают продольные полоски (по О,5 см шириной), которые проявляют бензидиновым реагентом. Зоны хроматограмм, соответствующие проявившимся на полосках пятнам, отрезают и отдельно экстрагируют метанолом. Получают 12 экстрактов (по 4 с каждого листа). Метанольные экстракты упаривают Досуха и остатки взвешивают. Содержание компонентов фракции иридоидов коровяка джунгарского, %: 6-пара-Кумароилаукубин, Rf 0,80 51,5±2,7 25,6±2,5 Аукубин,. Rf 0,51 14,0±{),5 Глюкоза, Rf 0,28 8,3±0,4 Сахароза, Rf 0,25 ,П р и М е р 3. Идентификация компонентов фракции иридоидов. Вещество с Rf 0,25 имеет.состав т.пл. 184-186°С, . Оно идентифицировано с сахарозой хроматографически и плавлением пробы смешения. Вещество с Rf 0,28, состав . 147с, идентично по хроматографическому поведению глюкозе. Вещество с Rf 0,51, состав 6-НС Н,„Оо, т.пл. 180°С (из водного . спирта); Го6Л| -170±3 (с-1,1, вода), (ацетильное производное, т.пл. 126127°С) идентифицировано хроматографически и сравнением ПМР-спектров (ацетатов) с аукубином.

Вещество с Rf 0,80 (1) имеет состав С24Н28Р, т.пл. 114-U5°C (из этанола), ,5 (с-0,48, метанол). Гексаацетильное производное состава C-jjjH O ,с т,пл. 61-б2° получили вьщерживанием 41 мг (1) в смеси 1 мл пиридина с 2 мл уксусного ангидрида в течении 24 ч, последующим разбавлением 100 мл воды, экстракцией хлороформом, промываИием хлороформного раствора водой, высушиванием безводным сульфатом натрия, отгонкой растворителя и перекристаллизацией остатка (49 мг) из смеси хлороформ - эфир 1:2.

Щелочной гидролиз (1). Раствор 70 мг (1) в 2,5 мл 0,05 н. раствора едкого кали оставляют при комнатной температуре на ночь, затем помещают на колонку с сефадексом LH-2Q. Колонку промьгоают водой. Водные элюаты .объединяют, упаривают досуха, остато перекристаллизовывают и получают 28 аукубина. i

В УФ-спектре (1) наблюдаются максимумы поглощения при 206, 219 и 310 нм, подтверждающие йридоидный характер (1) с незамещенной енолэфирной связью. В ПМР-спектре (1) имеются сигналы четырех протонов пара-замещенной бензольной системы, сигналы двух винильных протонов, характерных остатку транс-коричной кислоты, сигналы двух протонов незамещенной енол-эфирной системы при Ст и С аукубинового скелета, а также сигнал олефинового протока при 5,60 м.д. В ПМР-спектре гексаацет&та .наряду с сигналами пяти ацетоксигруп npii 2,00 м.д. имеется трехпротонный синглет одной ацетоксигруппы (при 2,26 м.д.) ,. находящийся при ароматическом кольце.В масс-спектрах (1) (и его гексаацетата) имеются пики .фрагментов с т/е 1.64, 147, 119 и, соответственно, 206, 189, 161, отвечающие иону П-ОКСИКОРИЧНОЙ КИСЛОТЫ (и п-ацетоксикоричной кислоты) и ионам, образовавшимся в результате последовательного выброса из нее гидроксила и окиси углерода.

Таким образом, (1) является аукубиновым эфиром п-оксикоричной кислоты. В масс-спектре гексаацетата (1) имеется интенсивный пик с т/е 33 соответствующий фрагменту тетрацетилглюкозы. Это показывает, что остаток параоксикоричной кислоты находится не при глюкрзильной части молекулы. Ацетилирование (1) сопровождается парамагнитным сдвигом сигя лов протонов двух оксиметильных групп на 0,42 м.д. Это означает, что в (1) остаток оксикоричной кислоты этирифицирует С -гидроксильную

группу аукубина.и, таким образом, строение (1) соответствует структуре 6-п-кумароилаукубина О увеличении доз статистически значимые положительные сдвиги исчезали и появлялись их Отрицательные эффекты Как однократное введение фракции иридоидов и экстракта элеутерококка так и двукратное введение фенамина и пиридрила не приводило к увеличению работоспособности крыс. В отдельной серии опытов была определена выносливость крыс к комбинированному стрессу при введении смеси глюкозы и сахарозы в количестве, соответствующем их содержанию во фракции иридоидов, при дозе 30 мг /кг. Смесь глюкозы и сахарэзы вводили два раза в сутки внутрибрюшинно или подкожно из расчета 4,2 кг/кг глюкозы и 2,49 мг/кг сахарозы. При подобной постановке опы та не выявлено повышение выносливос ти как при внутрибрюшинном, так и при подкожном введении. Эти данные указывают, что из компонентов фракции иридоидов существенную роль, в повышении физичес кой выносливости в условиях стресса играет смесь б-пара-кумароилаукубин и аукубина. Острую.токсичность фракции иридоидов, экстракта элаутерококка, пи ридрола и фенамина изучали в опытах на белых мышах весом 20-22 г. Препа раты растворяли в 0,2 мл воды и вво дили внутрибрюшинно мышам. Каходую дозу следовали на шести животных, которых помещали в клети размером .22-35 см при температуре 22°С. По Литчфильду-Уилксону подсчитывали препаратов, которая для фракци иридоидов составила 12200 (1184412566) мг/кг, для экстракта элеутер кокка - 5600(4409-7112) мг/кг, для фенамина 137.(126-149) мг/кг и для пиридрола - 117(96-143) мг/кг. Подсчеты показали, что .различие в токсичности фракции иридоидов и о тальных контрольных препаратов значимо при ,001, т.е..фракция ири,доидов в.два раза менее токсична, чем экстракт элеутерококка, и почти в 100 менее, чем фенамин и пиридрол .Отношение препаратов к их максимально эффективным дозам следукхцее: фракция иридоидов 488, экстракт элеутерококка 112, пиридрол 93, фенамин 68. В опытахна наркотизированных не:мбуталом крысах весом 180-200 г изучали действие фракции иридоидов и контрольных препаратов на артериальное давление и частоту дыхания Артериальное давление регистрировали в бедренной артерии (предварительно вводили 500 ед/кг гепарина) с помощью ртутного манометра, о час тоте дыхания судили по количеству входов в минуту. Испытуемые вещества раствор5 ли в дистиллированной во де и вводили в бедренную вену. Фракция иридоидов какв дозе 10 мг/кг, так и в дозах, превышающих максимально эффективную дозу, не вызывает у крыс статистически достоверных изменений артериального давления. У пиридрола и фенамина сдвиги в артериальном давлении и дыхании обнаруживаются уже в меньших дозах, чем их эффективная доза, вызывающая повышение выносливости к комбинированному стресг:у. ,В указанных дозах фракция иридоидов и экстракт элеутерококка не действуют на частоту дыхания, в. то время как фенамин и пиридрол уже в дозах 0,5 и 2,0 мг/кг соотв.етственно увеличивает частоту дыхания. В опытах на семявыносящем протоке крысы исследовали действие фракции иридоидов и контрольных препаратов на .адренорецепторы и на проведение возбуждения через симпатические нервы. Это действие определяли по изменению (в % к контролю) сокращений семявыносящего протока, вызванных адреналином в концентрации 1 -10 г/мл и трансмуральным электрическим, раздражением. Фракция иридоидов и экстракт элеутерококка испытывались в конечной концентрации г/мл, а фенамин и пиридрол в концентрации 0,05 мкмоль/мл. Полученные данные свидетельствуют о том, что фракция иридоидов и экстракт элеутерококка не действуют на симпатические нервы и .адренорецепторы семявыносящего протока крысы. Пиридрол обладает значительньм, но кратковременнЕлм симпатолитическим и длительным адреномиметическим действием, а фенамин блокирует адренорецепторы. Полученная по предлагаемому спо- , ,собу фракция иридоидов, состоящая из смеси аукубина (25,6i2,5%), 6-п-кумароилаукубина (51,5+2,7%), глюкозы (14,010,5) и сахарозы (8,3±0,4%), обладает выраженным свойством повыилать выносливость к комбинированному стрессу и в отличие от прототипов цо действию (фенамина,пиридрола и экстракта элеутерококка) проявляет активность в более широком диапазоне доз, значительно менее токсична, а стимулирующее действие не сопровождается изменением артериального давления и другими симпатомиметическими ,-Эффектами. Фракция иридоидов может быть исполь,зована для повышения физической работоспособности здоровых людей в нормальнь1Х и специальных условиях (например, в условиях невесомости или сурового климата, вызывающих. -7 соответственно, повышенный прилив крови в верхнюю половину тела или гепотермию), а также при заболева10283358ниях, сопровождающихся пониженной работоспособностью, вялостью, адин. амией.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФРАКЦИИ ИРИДОИДОВ, ОБЛАДАЮЩИХ СПОСОБНОСТЬЮ ПОВЫШАТЬ ФИЗИЧЕСКУЮ РАБОТОСПОСОБНОСТЬ, путем экстракции надземной части растения рода Verbasctom низшим спиртом с последующим упариванием, промывкой бензолом и очисткой на колонке с сорбентом, отличающийся тем, что, с целью .расширения сырьевой базы, в качестве растворителького сырья используют коровяк джунгарский (Verbascum songaricum Schrenk), который экстрагируют метаноллом при соотношении сырье:экстрагент - 1: