Нитрофенилдисульфидное производное сшитой агарозы в качестве хемосорбента для изучения белок-белкового взаимодействия и способ его получения Советский патент 1983 года по МПК C08B37/00 B01J20/24 

Изобретение относится к химической технологии, конкретно к хемосорбентам для изучения белок-белкового взаимодействия и способам получения таких хемосорбентов и может быть использовано в научных исследованиях по химии и физической химии белков, в энзимологии и молекучярной биологии . Известен хемосорбент, который использовался .для получения стабилизированного внутримолекулярными сшивками папаина и для изучения, взаимодействия между различными группировками в молекуле этого белка GilСНг .:иX ч-- (Т) БСнс;НгСн со1 н.сн.снг- 5-{О/ ооБнснгСооя СН„ COQH где(Я)- сшитый агарозный гель (ЦЛ-се фароза. Преимуществом хемосорбента являет то, что в качестве исходной матрицы для него используют поперечно-сшитый гель агарозы - ЦЛ-сефароза, который в процессе производства подвергается щелочному десульфированию, что приводит к удалению сульфогрупп примесного агаропектина с полисахаридной основы. В данном продукте полимерные цепи ковалентного сшиты, поэтому имеется возможность постепенного введения дегидратирующего органическс1го растворителя убрать из геля воду и затем высушить его, что в дальнейшем дает возможность значительно повысить точность количественных экспериментов. Однако емкость данного кемосорбен та по активным группировкам (3,9 мкмоль/мл) значительно выше необходимой, структура промежуточной группировки ( так называемой ножки) содержит ионогенные группы: катионообменные (СООН ) и анионообменные ( третичные аминные)J активирующие дисульфидные связи хемосорбента пиридильных группировок также облада ет анионообменными свойствами. Способ получения известного хемосорбента включает следующие стадии: 1.Окисление ЦЛ-сефарозы периодатом натрия для получения носителя с альдехидными группировками. 2.Присоединение к носителю прйрбдного пептида глутатиона с образов нийм на носителе альдиминных структур . 3.Восстановление этих альдиминных группировок действием натрийборгидрида, удаление избытка восстановителя от полученного тиолпроизводного.. 4.ОбрабЬтку тиолпроизводного 2,2-дипиридилдисульфидом с - целью получения способных к тиол-дисульфид ному обмену 2-пирйдилдисульфидных группировок хемосорбента. К недостаткам данного способа относится неоднозначность получаемых Б результате синтеза структур, поскольку при обработке альдегидного производного ЦЛ-сефар.озы глутатионом реакция идет не только по NH -группам последнего, но и по тиольным группам Вследствие этого, образуются не только необходимые структуры, но и нежелательные продукты побочной реакции - структуры с глутатионом, присоединенным-к матрице сульфидной связью. Цель изобретения - повышение точности, экспериментов при изучении белок-белкового взаимодействия. Указанная цель достигается структурой нитрофенилдисульфидного производного сшитой агарозы формулы (grOCKjCHCHj CKjCttOiCn - $Эоя ко ок ло где(к)т- сшитая 10 вес.% 2,3-дибромпропан-1-ола агароза формулы CKjffli о .с размерами пор в набухшем состоянии, обеспечивакяцими пределы исключения по белкам до 4.10 дальтон, по полисахаридам - до 2.10 дальтон, что со.ответствует гидродинамическому диаметру пор до 500 . ( .. Нитрофенилдисульфидное производное оаитой агарозы получают путем последовательной обработки сшитой 10 вес.% 2,3-дибромпропан-1-ола агарозы эпихлоргидрином, 1,4-дитио-2,3диоксибутаном в водной среде при рН 7,2-8,5, затем водным раствором 2-меркаптоэтанола и после промывки полученного производного - раствором нитрофенилсульфенидхлорида в уксусной кислоте при соотношении сшитой агарозы, эпихлоргидрина, 1,4-дитио-2,3-диоксибутана и нирофенилсульфенилхлорида, равном 1000:30erOOtl-20:10-200.

Последовательность химических превращений при получений предлагаемого

ClCHjdt-CHj. )-01t, CR

OR-

Q-oCHiCHCHj cHjCHCHCHjeK

OH HO Oft Схема синтеза разработана таким образом, чтобы исключить неоднознач ность получаемых структур, а исполь вание на каждой стадии точно рассчи танного количества реагентов обеспе чивает необходимую емкость хемосорбента по активным функциональньп группировкам. Синтез проводят следующим обраэом. Исходную матрицу - ЦЛ-сефарозу обрабатывают в щелочной среде эпи. хлоргидрином с целью введения на по сахаридную основу эпоксигрупп, при используется весовое соотношение ЦЛ сефароза (сухая) - эпихлоргидрин, равное 1000:30-600, Далее при рН 7,2-8,5 при комнатной температуре обрабатывают эпокси проивводное ЦЛ-сефарозы в водной среде дитиотреитом (ДTT. Количеств реагента рахзчитано таким образом, чтобы в получаемом тиолпроизводном содержалось бы 0,01-0,2 мкмоль SHгрупп на 1 МП геля. Поэтому эпоксипроивводное обрабатывают ДТТ при ве вом соотношении ЦЛ-сефароза - ДТТ, равном 1000:.1-20, Время реакции 424 ч. После отмывки от продуктов реакции проводят обработку тиолсодержащего носителя большим избытком 11000-кратным 2-меркаптоэтанола (2-МЭ), чтобы обеспечить полное вое становление всех тиольных групп и .блокировать возможно оставшиеся эпо сигруппы. Последнюю стадию в синтезе - акт вацию тиольных групп носителя - про водят обработкой в среде уксусной кислоты избытком нитрофенилсульфенилхлорида по методике получения смешанных дисульфидов из тиолов и сульфенилхлоридов. Используют весовое соотношение ЦЛ-сефароза - нитро фенилсульфенилхлорид, равное 1000j 10-200. После окончания реакции и отмывки геля от реагентов проводят :следовательную промывку целевого хе мосорбента дегидратирующими органическими растворителями и сушку продукта. Пример. Влажный промытый дистиллированной водой гель ЦЛ-сефа

изображена на схехемогорбентаме:

1)н$СНгСнснсЯг$н но OR

-QCHjCHCHj

Y

ITOi розы в количестве, соответствующем 3 г сухого материала, помещают в колбу и заливают SO мл 0,1 н. NaOH. При интенсивном переметиивании вносят 90 мг эпихлоргидрина и нагревают реакционнуто массу при интенсивном перемешивании 2 ч при ЗЗ-бО С. Далее переносят нерастворимое вещество на стеклянный фильтр, промывают его на фильтре 0,1 н. NaOH (2x50 мл), бидистиллированной дезаэрированной водой до нейтральной реакции и затем промывают 0,06 М Na-фосфатным буфером с рН 7,2 2x50 ьш). Влажный гель помещают в колбу, добавляют 100 мл того же буфера и 3 мг ДТТ. Реакционную массу перемейиивают 4 ч при комнатной температуре. Затем нерастворимый продукт промывают на фильтре тем же буфером (2x50 мл), бидистиллированной цезаэрированной водой нейтральной реакции, 0,1 н. HCI ( 2x50 мл), такой же водой до нейтральной реакции. Помещают промытый гель в колбу, заливают буфером и прибавляют 3 мл 2-МЭ. Перемешивают суспензию 2ч при комнатной температуре. Вновь переносят вещество на фильтр, промывают бидистиллирован- ной дезаэрированной водой до отсутствия тиолов в промывках и суспендирук|т гель в 50 мл раствора 30 мг нит- , рофенидсульфенилхлорида в уксусной кислоте. Перемешивают реакционную массу 2 ч при комнатной температуре. Нерастворимый продукт отфильтровыЬают, промывают на фильтре уксусной кислотой {2x50 мл), 0,1 н. НС1(50мл), бидистиллированной водой до нейтральной реакции, 1р%-ным МеОН (2x50 мм),50%-ным МеОН (2x50 мл), 80%-ным МеОН (2x5-0 мл) ,МеОН(5х50 мл), смесью МеОН - ацетон 1:1 (2x50 мл) и ацетоном (0,5 л). Сушат вещество в вакуум-эксикаторе над CaCl2 при 0,1 торр. , . Выход 2,82 1. «йбухаемость продукта в 26 мл/г. Емкость полученного хемосорбента по нитрофенилдисульфидным группировкам, найденная фотометрическим анализом при исчерпывающем восстановлении точной навески вещества избытком 2-МЭ в водном буфере при рН 7,4, составляет , : i 0,26 мкмоль на грамм сухого,или

1. Нитрофенилдисульфидное производное сшитой агароэы формулы R)-omjCHCHj, $ciijCttcacHj- $рСИ . ЛО (Ж сшитая 10 вес.% 2,3-да1бромпропан71-ола агароза формулы работки сшитой 10 вес.% 2,3-дибром- , пропан-1-ола агарозы эпихлоргидрином. 1 4-дитиб-2,3-диоксибутаном, в водной среде при рН 7,2-8,5, затем водным раствором 2-меркаптоэтанола и после промывки полученного производного раствором нитрофенилсульфенилхлорида в уксусной кислоте при соотношении лиитой агарозы, эпихлоргидрина, 1,4-дитио-2,3-диоксибутана и нитрофе №лсульфенилхлорида, равном 1000:30500:1-20:10-200.