@ (11 @ ,17 @ )-11,17-Дигидрокси-3,20-диоксопрегн-4-ен-21-ил @ тио @ уксусная кислота как промежуточный продукт в синтезе биоспецифического сорбента и способ ее получения (его варианты) Советский патент 1985 года по МПК C07J31/00 B01D15/08 

ты в смеси ацетона и низшего алифатического спирта с последующим выделением целевого продукта подкислением реакционной-массы и выса.живанием водой,

3. Способ получения Г(1 ф, 17об)-11,17-дигидрокси-З,20-диоксопрегн-4-ен-21-шт)тио |уксусной кислоты, заключающийся в том, что 21-галоидпроизводное кортизола формулы

гх , с«о Ho /xAjOH

JTJ

CTN.где X С1, -Вг,

подвергают взаимодействию в среде низшего амида или смеси низших амидов с тиогликолевой кислотой при 60-90°С с

последующим вьщелением целевого продукта высаживанием водой.

1.. C

1

Изобретение относится к органической химии, конкретно к синтезу аффинного биоспецифического сорбента для выделения транспортных белков крови.

Близким по структуре к предлагаемому соединению является метиловый эфир {(3,20-диоксопрегн-4-ён-21-ил) тио1 уксусной кислоты l

Однако использование его как производного аффинанта невозможно в силу того, что аминолиз сложнозфирной связи с образованием амида протекает в присутствии (5-15)кратного избытка амина, необходимого как для создания рН среды от 10 до 12, так и для конкуренции с реакцией переэтарификации. Тем.не менее, количество концевых аминогрупп, являющихся действующим началом в данном процессе, на модифицированной поверхности полисахарида в тысячи раз меньше количества гидроксильных групп. Искусственное поддержание рН среды введением основания ведет к предпочтительности реакций переэтерификации или омыления, что нежелательно.

Известным полупродуктом в синтезе используемых в настоящее время биоспецифических аффинных сорбентов является 21-гемисукцинат кортизола 2 .

Однако использование последнего в качестве аффинанта неудовлетворительно в силу легко протекающего как химического (устойчив в пределах рН 5-7), так и биохимического

(требует дезактивации или удаления эстеразных ферментов) расщепления сложноэфирной связи Yj и 4 . Известен способ получения ряда

21-сульфидных производных прогестерона и дексаметазона ij , заключающийся в обработке 21-хлорида :или мезилата дезоксикортикостерона (10-15)-эквивалентными избытками метилового эфира тиогликолевой кислоты и триэтиламина в среде ацетона при .

Одним из существенных недостатков известного способа является использование больших избытков как основания, так и тиола, что вызьгаает трансформацию стероидного скелета (в приложении способа к кортикостероидам, обладающим 17о4, 21 -дигидроксиацетоновой группировкой) и усложняет вьщеление целевого продукта, который необходимо подвергать хроматографической очистке. Кроме того, по известному способу может быть

получен только метиловьй , 17оо)-11,17-дигидрокси-З, 20-диоксопрегн-4-ен-21-ил тиоЗ уксусной кислоты, которьш непригоден для получения аффинного сорбента, так как недостаточно специфичен и избирателен.

Цель изобретения -(11/3, 17ot)-11,17-дигидрокси-З,20-диоксойрегн-4-ен-21-ил тио уксусная кислота как промежуточный продукт в синтезе 5 биоспецифической матрицы и способы ее получения.

Поставленная цель достигается соединением - (11/, 17об)-11,17-ди- гидрокси-3,20-диоксопрегн-4-ен-21-ил}тио уксусной кислотой формулы pS-CH -COOH он JxAJ которая является полупродуктом в синтезе новой биоспецифической матрицы формулы pS-CHiCONH(CH2)4NHCHiCH(OH) ш где Р -. остаток сефарозы 4В., применяемой для выделения транспорт ных белков крови. Синтез матрицы пр водят по следующей схеме: гель моди фицированной сефарозы, полученньй последовательной обработкой сефароз эпихлоргидрином и гексаметилендиамином в присутствии гидроокиси нат рия, подвергают взаимодействию в водно-диоксановой среде с ангидридо t (11(it 17вЬ)-11,17-Дигидрокси-3,20 -диоксопрегн-4-ен-21-ил тио уксусной кислоты с последукицей отмывкой водным диоксаном, раствором бикарбо ната натрия и дистиллированной водо Полученная таким образом биоспецифическая матрица (II) показала ,при сравнении с используемой в настоящее время матрицей 5 формулы rS-CHtCONH(CH2)eNHCHjCH(OH)CH,-0-P 6.0 /где Р - остаток сефарозы АВ, что при взаимодействии с сывороткой крови потеря активной части матрицы составляет в среднем 20% в случае использования как аффинанта 21-гемисукцината кортизола и только около 1% в случае (11|, 17о(,)-11 tl -дигидрокси-3,20-диоксопрегн-4-ен-21-ил } тио уксусной кислоты за каж дую экспозицию. 124 CL(11|}, 17рб)-11,17-Дигидрокси-3,20-диоксопрегн-4-ен-21-яп тио уксусная кислота при сравнении с 21-гемисукцинатом кортизола и кортизолом имеет следзпощее сродство к сьгоороточному транскортину, %: Кортизол 100 21-Гемисукцинат кортизола 63,6 (Кортизол-21-ил) уксусная кислота 81,8 т.е. не уступает кортизолу и превосходит используемый в качестве аффинанта 21-гемисукцинат кортизола. tL(n/3, 17оЬ)-11,17-Дигидрокси-3,20-диоксопрегн-4-ен-21 -ил уксусную кислоту получают двумя способами. Вариант А. Раствор 21-Х-производного кортизола (где X - OSO-CHgi, -OSOjCgH CH } -Cl, -Br) обрабатывают раствором динатриевого производного тиогликолевой кислоты. Затем реакционную смесь подкисляют до рН 4-5, разрушая образующуюся натриевую соль кислоты, удаляют 1/2--2/3 растворителя и высаждают целевой продукт водой. Обработка маточника дает дополнительное количество целевого продукта. Суммарный выход достигает 90-95% от теоретического. Предпочтительно осуществление процесса в атмосфере инертного газа. Предлагаемый способ позволяет осуществлять процесс в условиях контролируемого основного катализа . и представляет возможность введения полифункциональных (в частйости бифункционального) заместителей избирательным присоединением последних через простую сульфидную связь. Вариант Б: 21-Галоидпроизводное кортизола в среде низшего амида или смеси низших амидов подвергают взаимодействию с тиогликолевой кислотой при 60-90с в течение 1,5-4,5 ч. За ходом реакции следят хроматографически. Целевой продукт выделяют последовательным высазкдением спиртом - водой. Выход достигает 84-89%. Предпочтительно осуществление процесса в атмосфере инертного газа. Способ позволяет осуществлять процесс в нейтральной среде (отсутствие оснований), что очень существенно в приложении его к кортикостероидам, обладающим 17,21-дигидроксиацетоновой группировкой. Выделяющийся в процессе галоидводород связы- . зается N-незамещенным амидом, позволяя поддерживать рН среды, равное 6,5-7,0.

Отличительными особенностями предлагаемого способа является использование динатриевого производного тиогликолевой кислоты, которое избирательно взаимодействует с 21 мезилатом, тозилатом, хлоридом или бромидом кортизола. Целевым продуктом в этом случае является кортизол-21-ил-21 тиоуксусная кисло та, которая не может быть получена по известному спосрбу.

П р и м е р 1. Получение ft(11 17сб) -11,17-дигидрокси-3,20-диоксопрегн-4-ен-21-ил тиоЗ уксусной кислоты (способ А).

К раствору 1,292 г (2,5 ммоль) 21-Н-толуолсульфоната кортизола в 30 мл ацетона в токе аргона прибавляют свежеприготовленный раствор динатриевого производного тиогликолевой кислоты, полученный из 0,188 мл (2,7 ммоль) тиогликолевой кислоты в 8 мл спирта и 4,15 мл спиртового этилата натрия, содержа щего 0,0013 г-атом активного натрия в 1 мл раствора. За ходом реакции следят хроматографически (окись алюминия, хлороформ:метанол:вода 188:12:1, 1) и по изменению рН среды. По окончании реакции реакционную смесь подкисляют до рН 4-5, прибавляя 10%-ный раствор соляной кислоты, упаривают при пониженном давлении при 20-30 С до 15-20 мл и прибавляют в течение 0,5-1 ч 100-120 мл воды. Выделившуюся Ct(11|5, 17оЬ)-11,17-дигидроксиг-3,20-диоксопрегн-4-ен-21 -ил тио уксусную кислоту отфильтровьшают 5 промывают на фильтре водой, сушат в вакуум-эксикаторе над ангидроном. Получают 1,00 г кислоты с Т 182185с. Маточник упаривают на 1/5 объема и оставляют на холоду на ночь, получая дополнительно 0,108 г кислоты с Тдд 182-185 0. Общий выход составляет 1,108 г 21-5-уксусной кислоты кортизола в виде кристаллогидрата с 1 моль воды или 97,57% от теоретического в пересчете на 21-5-уксуснзто кислоту кортизола. Кристаллизация из хлороформа дает аналитический образец с

184,3-185,5 С.

-т

Найдено, %: С 63,27; Н 7,38; S 7,33.

. Сг,ИзгОб5

Вычислено, %: С 63,27; Н 7,39; S 7,34.

ИК-спектр ( , см ) 3540-3530; 3300-2500; 1725; 1645;.1610; 1275; 1125 (КВг).

УФ-спектр ( . CjHjOH , нм) 243 (г 16034,( + 142° (спирт, 1%ньй раствор).

ПМР-спектр (CflCfj),8 : 0,, синглет, ЗН} 1,48, синглет, ЗН, 2,76, мультиплет, 1Н; 3,32, дублет j 2,85 Гц, 2Н,- 3,60, дублет, j 17,13 Гц, 1Н; 3,97, дублет, 17,13 Гц, 1Н; 4,41, мультиплет, 1Н, 4,63, синглет, 2Н; 5,68, синглет, 1Н.

Пример 2. Получение Г (Ир, )-11,17-дигидpoкcи-3,20-диоксопрегн-4-ен-21 -ил тио уксусной кислоты (способ Б).

Продуваемую аргоном смесь 1,028 г (2,7 ммоль) 21-хлорида кортизола, 0,5 мл (5,4 ммоль) тиогликолевой кислоты, 0,42 мл (5,4 ммоль) Н,М-диметилформамида (ДМФА) и 0,160 г (2,7 ммоль) ацетамида (АЛ) нагревают при 80-90 С в течение 3,5 ч. За ходом реакции следят хроматографически (силуфол, этилацетат, УФ-облучение). Затем реакционную смесь охлаждают, разбавляют .10 мл спирта, прибавляют в течение 0,5-2 ч 100 мл воды и оставляют на холоду (0-5 С) на 18-20 ч. Выделившуюся С (11/3, 17of)-11,17-дигидрокси-3,20-диоксопрегн-4-ен-21-ил тио} уксусную кислоту (кристаллогидрат 1 моль воды) собирают фильтрованием, промывают на фильтре водой, сушат в вакуум-зксикаторе над ангидроном. Получают 1,044 г 21-5-уксусной кислоты кортизола в виде кристаллогидрата с 1 моль воды или 85,1%-ом теоретического в пересчете на 21-5-уксусную кислоту кортизола с Tjj 181-184 с. Кристаллизация части из зтилацетата дает образец с Т „, 183-185 0, по всем характеристикам идентичный продукту,полученному в примере 1.

Другие примеры конкретного выполнения приведены в таблице. Способ .получения биоспецифического сорбента. Сефарозу 4В (100 мл) промывают на фильтре 1 л дистиллированной . воды, переносят в круглодонную колбу, содержащую 80 мл 1 N NaOH и прибавляют 10 мл эпихлоргидрина. После двухчасового перемешивания при 30-40 С гель тщательно промьюают ра фильтре дистиллированной водой и инкубируют 2 ч с раствором 12 г гексаметилендиаминё в 100 мл 0,01 N NaOH, Образовавшуюся аминоалкилсефарозу промьшают дистиллированной водой до отрицательной нингидринной реакции промывных вод. К 10 мл полученного водного геля аминоапкилсефарозы прибавляют при перемешивании в течение 1-1,5 ч 180-190 мл диоксана, избыток растворителя удаляют, доводя объем до 10 мл. Раствор 0,425 г (0,97ммо tt (11/3. 17о)-11,17-дигидрокси-3,2 -диоксопрегн-4-ен-21 -шз тио уксусной кислоты и 0,204 г (0,99ммол дициклогексилкарбодиимида в 15 мл диоксана перемешивают 2-24 ч при комнатной температуре, осадок отфильтровьгеают, фильтрат прибавляют к полученной водно-диоксановой суспензии аминоалкилсефарозу. Смес упаривают при пониженном давлении и температуры не вьш1е 40°С до объе ма 10-15 МП. После перемешивания в течение 18-24 ч гель отфильтровьтают, промьгоают на фильтре з«15 мл диоксана содержшцего 5% воды, прибавляют 10 мл диоксана, содержащего 5% воды и затем при перемешивании в течение 1-1,5 ч прибавляют 180-190 мл воды Полученный водный геЛь отфильтровывают , промывают на фильтре последовательно 200-300 мл 1-2%-ным водным раствором NaHCO и 400-500 мл дистиллированной воды. При необходимос ти матрицу можно привести в стандар ный буфер либо сразу после приготов ления, либо непосредственно перед использованием. Непрореагировавшую t (1ф, 17об)-11,17-дигидрокси-3,20диоксопрегн-4-ен-21-ил тио уксусную кислоту можно использовать повторно без дополнительной очистки. Полученная таким образом биоспецифическая матрица содержит 3,08 мг (7,07 мкмоль) ЕС (11/5, 17об)-11,17дигидрокси-3,20-диоксопрегн-4-ен-21-ил тиоЗ уксусной кислоты на Г мл уплотненного геля сорбента и имеет емкость 32% от максимально возможной емкости модифицированной сефарозы. Транскортин - транспортный белок крови человека является необходимым препаратом как для детального исследования белок-стероидного взаимодействия, так и для практического использования, например, в ранней диагностике нарушений гормонального баланса и обмена в организме. Однако возможности его получения ограничены, поскольку отсутствуют высокозффективные биоспецифические матрицы. Предлагаемая в качестве промежуточного продукта в синтезе,.а соответственно, в качестве аффинанта в матрице 1(11/5, 17об) -11,17-дигидрокси-3,20-диоксопрегн-4-ен-21-шт тио уксусная кислота позволяет устранить основные недостатки используемых биоспецифических матриц: незначительные сроки использования (2-3 вьщеления), низкий коэффициент извлечения, обусловленный отщеплением аффинанта, дезактивирующего извлекаемый белок; устранение длительных операций, связанных с дезактивацией сывороточных- эстераз,; снижение материальных энергетических и финансовых затрат, так как способ отличается простотой и при этом используются достзшные и относительно недорогие материалы и препараты и т.п. Срок службы биоспецифической матрицы при использовании предлагаемого производного кортизола по сравнению с известными матрицами повьш1ается в 10-20 раз.