АКТИВИРОВАННАЯ МАТРИЦА ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ БЕЛКОВ Советский патент 1994 года по МПК G01N33/50 C07K17/00 

Изобретение относится к области медицины, а именно клинической биохимии.

Целью изобретения является создание активированной матрицы для иммобилизации белков, более устойчивой и специфичной в сравнении с известной.

Для достижения поставленной цели используют новые полисахаридные матрицы, которые получают в три стадии: активация полисахаридного носителя эпихлоргидрином; раскрытие эпоксидного цикла аминокислотной, т. е. введение карбоксильной группы; этерификация N-оксисукцинимидом карбоксильной группы.

Схема получения активной матрицы I. П-OH П-O-CH₂-CH₂ III. П-O-CH₂--CH₂-NH-(CH₂)_n--OH П-O-CH₂--CH₂-NH-(CH₂)n--ON
Матрицы, полученные по этой схеме на основе сефарозы 4Б, содержат 5-10 мкмоль активных эфирных групп в 1 мл сорбента. Использование целлюлозы и сефадекса G - 200 в качестве полисахаридного носителя приводит к получению матрицы с содержанием эфирных групп 2-4 мкмоль в 1 мл сорбента.

Все эти сорбенты могут применяться для иммобилизации белков, в частности транскортина, секстероидсвязывающего глобулина, бычьего сывороточного альбумина, иммоноглобулинов, а также других лигандов, содержащих первичную аминогруппу.

Ниже приведены примеры получения активных матриц на основе различных полисахаридных носителей с применением различных аминокислот (n = 2,3).

П р и м е р 1. Получение матрицы на основе агарозы с применением
γ - аминомасляной кислоты.

I стадия. Получение эпоксиагарозы.

К суспензии 10 мл сефарозы 4Б (Pharmacia Fine Chemicals, Sweden) в 60 мл 0,4 М едкого натра, нагретой до 40^оС, при перемешивании прибавляют 4 мл эпихлоргидрина. Суспензию перемешивают 2 ч при 40^оС, после чего на стеклянном фильтре отмывают от избытков реагентов.

Найдено: 1 мл геля содержит 30-40 мкмоль эпоксидных групп.

II стадия. Получение карбоксильного производного агарозы.

К раствору 1 г γ -аминомасляной кислоты в 20 мл 1 М раствора едкого натра прибавляют 10 мл полученной эпоксиагарозы. Смесь перемешивают 2 ч при 40^оС. Полученное производное агарозы промывают сначала 0,2 М соляной кислотой, затем дистиллированной водой.

Найдено: 1 мл геля содержит 28-35 мкмоль карбоксильных групп.

III стадия. Этерификация карбоксильных групп.

Для связывания лабильных карбоксильных групп производное агарозы 30-40 мин перемешивают в 0,1 М раствора едкого натра, затем отмывают дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод (рН 7). Агарозу постепенно переводят в диоксан. К суспензии 10 мл карбоксиагарозы в 30 мл диоксана прибавляют 0,35 г N-оксисукцинимида и после его полного растворения 0,62 г дициклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают 18-20 ч при комнатной температуре. Сорбент отфильтровывают и промывают диоксаном (80 мл), метанолом (40 мл) и снова диоксаном (40 мл).

Найдено: 1 мл геля содержит 7-10 мкмоль активных N-оксисукцинимидных эфирных групп.

П р и м е р 2. Получение активированной матрицы на основе целлюлозы с использованием β -аланина.

Активированную β -аланинцеллюлозную матрицу получают, как описано в примере 1, только в стадии 1 при получении эпоксицеллюлозы реакцию проводят в 1 М растворе едкого натра. При этом получают продукт, содержащий 16-18 мкмоль эпоксидных групп в 1 мл сорбента. В стадии II вместо γ -аминомасляной кислоты используют β -аланин. Продукт реакции содержит 13-15 мкмоль карбоксильных групп в 1 мл сорбента. Стадию III проводят без изменения. Получают активированную матрицу с содержанием 2-4 мкмоль эфирных групп в 1 мл сорбента.

П р и м е р 3. Получение активированной матрицы на основе сефадекса с использованием γ -аминомасляной кислоты.

Матрицу на основе сефадекса получают, как описано в примере 1, только вместо агарозы берут сефадекс G - 200 (Pharmacia Fine Chemicals, Sweden).

Найдено: содержание эпоксидных групп 13-16 мкмоль/мл, содержание карбоксильных групп 11-14 мкмоль/мл геля, содержание эфирных групп 1-3 мкмоль/мл геля. (56) Cuatrecasas P. and Parikh I. Adsorbents for Affinity Chromatography. Use of N - Hydroxysuccinimid Esters of Agarose. - Biochemistry, 1972, v. 11, p. 2291-2299.

Изобретение относится к клинической биохимии. Цель изобретения - создание активированной матрицы для иммобилизации белков, более устойчивой и специфичной. К суспензии сефарозы 4B в 60 мл едкого натра при перемешивании прибавляют 4 мл эпихлоргидрина. Затем на стеклянном фильтре отмывают от избытков реагентов. К раствору γ-аминомасляной кислоты в растворе едкого натра прибавляют 10 мл полученной эпоксиагарозы. Смесь перемешивают 2 ч при 40С. Полученное производное агарозы промывают соляной кислотой, а затем дистиллированной водой. Производное агарозы перемешивают в растворе едкого натра, затем отмывают дистиллированной водой до нейтральной реакции. Агарозу постепенно переводят в диоксан. К суспензии карбоксиагарозы в 30 мл диоксана прибавляют N-оксисукцинимид и после его полного растворения дициклогексилкарбодиимид. Сорбент отфильтровывают и промывают диоксаном, метанолом и снова диоксаном.

Активированная матрица формулы
П-O-CH₂--CH₂-NH-(CH₂)n--ON
где П - остаток агарозы, сефадекса или целлюлозы,
n = 2 или 3, для иммобилизации белков.