Способ получения сорбента для лигандообменной хроматографии белков Советский патент 1988 года по МПК C08B37/12 B01J20/30 C08J5/20 

со со

О1

О5 4

Изобретение относится к препаративной биохимии и биотехнологии, а точнее к способу получения халатных сорбентов для лигандообменной (метал лохелатной) хроматографии белков, содержащих в качестве стационарного лиганда иминодиуксусную кислоту (ИДК и может быть использовано для вьще- ления белков и ферментов на различ- ных этапах их очистки, включая вьще- ление непосредственно из культураль- ной жидкости.

Цель изобретения - получение сор- эента с повышенной сорбционной актив ностью по отношению к белкам.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. К 100 г промытой водой и отжатой на пористом фильтре агарозы добавляют 100 мп 2 М NaOH и 30 МП эпихлоргидрина и ведут активацию 16 ч при при непрерывном перемешивании. Активированную агароз промывают на пористом фильтре водой до рН 7,0, 1 л ДМСО и 300 мл безводного ДМСО. В 200 мл безводного ДМСО суспендируют 20 г (100 мМ) хлоргидра та диметилового эфира ИДК и добавляг ют 48 мл раствора СНзОНа (получен растворением 4,6 г металлического натрия в 100 мл безводного метанола) Раствор отфильтровывают от выпавшего рсадка NaCl, суспендируют в нем эпо- ксиактивированную агарозу и добавляют 10 мл раствора CHjONa. Реакцию ведут 16 ч при 20 С при непрерывном перемепшвании, Сорберт промывают водой, вьщерживают 20 мин в 0,2М P jS04, промывают водой до рН 7 обрабатьшают 0,1 М раствором j 1CuS64 5 мин при 20 с. Емкость полу- ; генного сорбента по ионам меди составляет 25-30 мкмоль на 1 мл геля (сорбент I).

П р и М е р 2. Активацию агарозы эпихлоргидрином проводят, как описано в примере 1. В 20 мл безводного ДМСО суспендируют 2,3 г (10 мМ) хлор гидрата дизтилового зфира ИДК и до- бавляют 5 мл раствора C, (получен растворением 1,2 г металлического натрия в 25 мл безводного этано- Ла). Раствор отфильтровывают от осадка NaCl и в нем суспендируют 10 г : поксиактивированной агарозы. Добавляют 1 МП раствора CiHjONa и ведут 1|)еакцию 16 ч при при перемешивании. Сорбент промьшают водой

5

0 5 о 5

п ,

5

0

(200 мл), вьщерживают 20 мин в 0,2 М серной кислоте, промывают водой до рН 7. Сложноэфирные группы омыляют 0,3 М раствором CuCl 3 мин при . Емкость полученного сорбента по ионам меди составляет 30-35 мкмолей на мл сорбента (сорбент II).

Пример 3. К Юг промытой водой и отжатой на пористом фильтре агарозы добавляют 10 мл 1 М NaOH и 5 мл диглицидилоБого эфира диэти- ленгликоля. Активацию проводят 5 ч при 20 С при непрерывном переменшва- нии. Агарозу промывают на пористом фильтре водой до нейтрального значения рН, 100 мл дасО и 30 мл безводного ДМСО. Присоединение диэтилового эфира ИДК проводят аналогично описанному в примере 2. Омыление сложно- эфирных групп проводят 0,1 М раствором ацетата меди в течение 5 мин при 20°С. Емкость полученного сорбента по ионам меди составляет 20-25 мкмоль на 1 мл геля.

П р и М е р 4 (сравнительный). 1,25 г ИДК растворяли в 12,5 мл 2 М растворе . В полученном растворе суспендировали 10 мл активированной агарозы. Реакционную смесь покачивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Сорбент промывали водой, обрабатывали 20 мин 0,2 М , промывали водой до нейтральной реакции и обрабатывали О,1 М раствором CuS04 5 мин при комнатной температуре. Сорбент промывали водой. Бьши получены синие гранулы агарозы (сорбент III).

Из полученных сорбентов I-III изготовляли колонки объемом 10 мл, которые уравновешивали водой. Затем колонки промьшали 0,015 М раствором ацетата натрия при рН 7,5. Из колонки, заполненной сорбентом III, вымывали 36 мкмоль меди. Затем вымывали адсорбированную медь 0,5 М раствором соляной кислоты. Из колонки с сорбентом I вымывали 256 мкмоль, из колонки с сорбентом II 368 мкмоль и из колонки с сорбентом III 151 мкмоль меди.

Содержание меди в растворе определяли по оптической плотности аммиачного раствора при 600 нм по калибровочной кривой.

На основе вытеснения связанной меди можно заключить, что при связывании дизтилового эфира ИДК количество

связанного лиганда составляет 25,6 мкмоль/мп, а в случае диметило- вого эфира ИДК 36,8 мкмоль/мп. При этом сорбент является монофункциональным. Об этом свидетельствует отсутствие меди в растворе при вымывании колонок 0,015 М раствором ацетата натрия. В то же время при обработке активированной агарозы щелочным раствором ВДК получен сорбент, который связывает 18,7 мкмоль/мп меди. При этом 3,6 мкмоль (19,2%) из этого количества является слабосвязанной.

Применение полученных сорбентов дпя очистки ферментов. Из сорбентов и III приготовили две колонки объемом по 3 мл и уравновесили 0,1 М Na- ацетатным буфером рН 6,5, содержащим 0,5 М хлористый натрий. На колонки наносили со скоростью 30 мл/ч по 30 МП культуральной жидкости эндо- нуклеазы Ser.marcescens (лиофильно высушенный препарат растворим в уравновешивающем буфере, рН 6,5),

Исходный раствор имел оптическую плотность при 280 нм 8,0 о.е./мл и нуклеазную активность 8800 е.а./мл После нанесения колонки промьши уравновешивающим буфером до отсутствия поглощения в злюате при 280 нм и элю- ировали фермент О,1 М Na-ацетатным буфером рН 5,0, содержащим 0,5 М хлористый натрий. На. колонке с сорбентом I очистка нуклеазы повысила ее удельную активность в 31,5 раз, выход ее составил 32%.

На колонке с сорбентом III удельная активность повысилась только в 10,2 раза при выходе 13%. Колонки с сорбентами регенерировали 0,2 М уксусной кислотой, содержащей 1,0 М хлорис

5

0

Q

0

5

0

5

тый натрий и уравнов)есш1И 0,1 М

Na-ацетатным буфером рН 7,0, содержащим 0,5 М хлористый натрий, 4 мг эндонуклеазы Вас.intermedius (лиофильно высушенный порошок содержит 95% фермента) растворили в 15 мл уравновешивающего буфера и по 7 мл раствора нанесли на каждую колонку. Оптическая плотность полученного раствора при 280 нм 0,52 о.е./мп. В случае сорбента I был отделен несорбировавшийся балластный белок, не обладавший нуклеазной активностью. После нанесения колонки промыли водой до полного удаления солей и элюи- ровали 0,1 М уксусной кислотой. С сорбента I нуклеаза была элюирована с выходом 82,5% и удельной активностью 260000 е.а./мл, соответствующей гомогенному ферменту. С сорбента III нуклеазу удалось элюировать только 0,1 М уксусной кислотой, содержащей 0,5 М хлористый натрий.

Формула изобретения

Способ получения сорбента для ли- гавдообменной хроматографии белков путем введения в структуру эпокси- дированной агарозы фрагментов имино- диуксусной кислоты, отличающийся тем, что, с целью получения сорбента с повышенной сорбци- онной активностью по отношению к белкам, эпоксидированную агарозу обрабатывают диметиловым или диэтиловым эфиром имйнодиуксусной кислоты в безводном диметилсульфоксиде в присутствии метилата или этилата натрия и далее омыпяют сложноэфирные группы 0,1- 0,3 М водным раствором соли меди.

Изобретение относится к способу получения сорбента для лигандообмен- ной хроматографии белков и может быть использовано для вьщеления белков и ферментов. Изобретение позволяет получать сорбенты с повышенной сорбци- онной активностью по отношению к белкам (увеличение удельной активности фермента нуклеазы при его очистке в 31 раз при выходе 32%). Эффект достигается за счет обработки эпоксидиро- ванной агарозы диалкиловым эфиром иминодиуксусной кислоты в безводном диметилсульфоксиде в присутствии ме- тилата или этилата натрия и последующего омыления 0,1-0,3 М водным раствором соли меди. i (Л

Составитель В.Мкртычан Редактор М.Недолуженко Техред Л.Сердюкова Корректор В.Бутяга

Заказ 2464/25

Тираж 434

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное