Способ определения моноаддуктов и диаддуктов ДНК Советский патент 1983 года по МПК C12N15/00 

т fli

Hf

is9

00

D

т

т

ш

W Иаобретение относится к способам определения первичных, неферментатив( ных поврежавний ДНК, в частности фуро кумариновых моно- и циадцуктов ДНК, . преимущественно 8 метоксипсораленовых МОНО-- и диадцукгов ДНК. Изобретение может быть использовано в исследованиях по научению фотохимических процессов связывания молекул ДНК с веществами фурокумаринового ряда, для изучения структурнофункциональной организации хроматина и хромосом, а также моле сулярных механи мов мутагенеза и репарации, Изобретен:и может быть использовано В прикладных .цедях при разработке тест-систем: определение мутагенов окружающей среды, промышленных мутагенов, контроля, на мутагенность лекарственных и химических препаратов. Известен способ определения диаддук тов ДНК для анализа стурктуры хромати на, согласно которому циаддукты ДНК регистрир уют в электронном, микроскопе в виде сшивок ДНК 1} . Наиболее близким к изобретению является способ определения,количества псораленовых моно- и циаддуктов ДИК-С Этот способ основан на выращивании клеток на питательной среде, содержащей , препаративном выделении ДНК, установлений ее концентрации, инкубации с меченым радиактивным изотопом Н триоксаленом, ультразвуковом фрагментирований препарата ДНК, сепарировании массы ДНК на порции, облучении ультрафиолетовыми лучами, разделении хроматографическим способом однонитёвых и двунитевых фрагментов ДНК, установлении концентрации ДНК во фракциях и опрецелении уровня мечения Н -триоксаленом в тех же фракциях. Недостатками этого способа являются невозможность получения количественных показателей перехода моноадцуктов в циаддукты ДНК в динамике этого процесса, а также невозможность определения количества моно- и диадцуктов ДНК при разных количественных соотношениях веществ фурокумаринового ряда и молекул ДНК. Кроме того, недостатком этого способа является использование Д предварительно меченой радиоактивным изотопом , а также использование меченого И -триоксалена. Цель изобретения - повьш1ение точности способа путем прямого измерения длины молекул ДНК и количественного подсчета аиаддуктов (сшивок) ДНК, а такясе путем косвенного определения количества моноаддуктов ДНК и скорости перехода моноадцуктов в диадаукты, упрощение способа путем использования на- Т.ИВНОЙ, немеченной радиоактивными изотопами ДНК и немеченного радиоактивны. ми изотопами вещества фурокумариново- го ряда, в частности немеченного 8-мето ксипсоралена. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения моноаддуктов и диаддуктов ДНК, включающему выращивание культуры клеток на питательной среде и препаративное выделе- ние ДНК, установление концентрации ДНК, инкубацию препарата ДНК с веществом фурокумаринового ряда, сепарацию полученного продукта, облучение его ультрафиолетовыми лучами, денатурацию его физическими и химическими средствами, регистрацию диаддукд-ов, при инкубации препарата ДНК с веществом фурокумаринового ряда в качестве препарата ДНК используют нативную ДНК с последующим облучением ультрафиолетовыми лучами, ДЛЯ регистрации моно-диаддуктов используют электронную микроскопию, а количество моноаддуктов рассчитывают. На чертеже представлен график зави- симости количества диаддуктов от вре- меня облучения. П р и м е р . Клетки китайского хоиячка выращивают на питательной ере- де по общепринятой методике без внесе среду веществ, меченных радиоак- тивными изотопами. Препаративным методом выделяют нативную ДНК и спектрофотометрически устанавливают ее кон1хентрацию. Всю исходную полученную ДНК инкубируют с веществом фурокумаринового ряда, в частности с 8чу1етоксипсораленом, не меченным радиоактивными изотопами. Для этого к раствору нативной ДНК в концентрации 5О-25О цкг/ып добавляют спиртовой раствор 8-ч 1етоксипсоралена до конечной концентрации 37 мкг/мп. Инкубацию проводят в 0,5-2,0 мл буферного раствора следующего состава: ОД JV5 Tris-нее, 0,01 МЭДТА (авунатриевая соль этилдиаминтетрауксусной кислоты) с рН 8,4 (буферЬ), при в течение 18-24 ч. Облучают всю инкубированную с 8метоксипсораленом ДНК ультрафиолетовыми лучами с длиной волны 337 нм, с помощью Импульсного лазера ЛГИ-21 .при комнатной температуре. Мощность дозы составляет 19,7 мВт/см , время облучения 1 мин. Псхгле облучения ДНК отмывают дважцы путем осаждения ее этиловым спиртом с послецукшим растворением в буфере 0. Часть исходного обработанного таким образом препарата ДНК оставляют для необратимой денатурации и электронно микроскопического анализа. Остальную часть препарата ДНК сепарируют на восемь отдельных порций объемом по 10О мял. Каждую порцию ДН облучают повторно длинноволновыми ультрафиолетовыми лучами с длиной волны 337 нм с помощью импульсного лазера ЛГЙ-21 при комнатной температуре разное время, в пределах от 20 до 550 ми Часть исходно обработанной ДНК и каждую порцию повторно-облученной ДНК по отдельности денатурируют необратимо Для этого ДНК нагревают при 2 мин в следующем составе: 5О мкл раствора ДНК, 1О мкл 30% глиоксаля, 1ОО мкл 99% формамида. После денатурации готовят известным способом препараты для электронной микроскопии. Электронно-микроскопическим методом измеряют длину молекул ДНК и количество сшивок (диаддуктов) в этих молекулах в каждой порции ДНК. Для этого, при просмотре препаратов в электронном микроскопе фотографййгют молекулы ДНК, которые содержат однонитевые участки в области сшивок однонцтевых молекул ДНК, соответствующие локализации диаддуктов. Измерение количества диаддуктов и длины молекул ДНК приведены в таблице Рассчитывают среднее количество диаддуктов на длкну молекул ДНК, выраженную в килобазах, и среднюю скорость прироста диаддуктов на 1 килоба- ЗУ за период увеличения времени поворотного облучения в двух порциях ДНК и вносят эти данные в .ту же таблицу. Полученные данные длины молекул ДН и количества диаддуктов при разном вре мени повторного облучения позволяют косвенно определить среднюю скорость перехода моноаддуктов в диацдукты за период увеличения времени повторного Ьблучения в двух порциях ДНК, которая соответствует тангенсу угла наклона прямой, проходящей через точки графика Средняя скорость перехода моноаддук FOB в диаддукты аиаддукт/кйлобаза, . . .мин , , вычисляется по формуле/ 11а-3 ч D--te- -де - средняя скорость перехода моноаддуктов в диаддукты; to-ot - тангенс угла наклона прямой; J) - количество диаддуктов на едн2- ницу длины молекул ДНК, зарегистрированное в порции ДНК с большим временем повторного облучения; р - количество диаддуктов на единицу длины молекул ДНК, зарегистрированное в порции Z1HK с меньшим временем повторного облучения; t - время повторного облучения порции ДНК с более длительным облучением; -fc - время повторного/облучения i порции ДНК с менее длительным облучением. В примере конкретного осуществления пособа средняя скорость прироста диадуктов на единицу длины ДНК в двух пориях повторно обработанной ДНК, вычисенная по указанной выще формуле; предтавлена следующими цифровыми данными. Средняя скорость прироста диаддуктов на 1 килобазу (на 1000 .вуклеотиднь1Х оследовательностей) за время облучения О - 24; 24 - 4О; 40 - piaBHa О; за время облучения, мин равна cooTBeTvственно 80 - 17.6, - 1,16710-, 176 - 220 - 2, 22О - ЗОО 0,825-10 ; 300 - 360 - 0,350-10 ; 360 - 544 - 0,179--10 4 Вычисляют количество моноаддуктов, возншсающих при первичном облучении исходного продукта ДНК косвенным методом. в трм случае, когда после облучения длинноволновыми ультрафиолетовыми лучами вещество фурокумаринового ряда удаляют из среды, содержащей ДНК, диад- дукты при повторном облучении длинноволновыми ультрафиолетовыми лучами возникают только из первично индуцированных моноаддуктов ДНК. В порциях повторно обработанной ДНК при увеличении времени облучения длинноволновыми ультрафиолетовыми лучами количество первоначально ВХХЗНШШ1ИХ моноаддуктов уменьщается за счет образования циацдуктов. При этом возникает такая ситуация, при которой количество диацдуктов в некоторых порциях ДНК в расчете на единицу длины молекул ДНК не возрастает, несмотря на увеличение времени облучения длинноволновыми ультрафиолетовыми лучами. Это свидетельствует о том, -что все моноад- дукты, способные образовать аиаддукты, 5102В трансформировались в диаддукты, что дает возможность косвенно определить ко личество моноадцуктов, возникших после первичного облучения, по формуле )п11и5 Л - количество моноаддуктов на единицу длины ДНК; Р , - количество диаддуктов на единицу длины ДНК в сепариро- tO ванньоспорциях ДНК, в которых все моноаддукты, способные перейти в диаддукты, трансформировались в диаддукты 15hilH количество диаддуктов на единицу длины ДНК ис Длина ДНК, кнлобаза102,2128 98,698,6 160,5 Среднее коли чество днад«-ч оуктов на 1„ кнлобазуОО О О 0,112 Средняя скорость пртроста дйадцуктоВ| на 1 кнлобазу О О О О I . . .19 ходырм препарате ДНК после nei B4Hofi обработки; К - эмпирический коэффиоиант, выражающий долю ц яю&а- дуктов, способных переходить в диаддукты. В примере конкретного осуществления способа длину молекул ДНК и ёряют в килобазах; 1 килобаэа равна 1ООО нукле отидных пар. В примере конкретного осуществления способа в соответствии с полученными даннымиD yjoy О,322 дяаддуктв-«ялоба за; J), диаддуктов/килобаза} ,в. Исходя из этого, (моноаддукты) .J. О, §37 моноадаукт/кнлобвза. 148,7 109,7 26О.6544,8 . 0,235 О,ЗО1 0,322О,289 7 -3 з-3-J :2,795100,825100,35О.1ОО,1791О , .