Способ разделения биополимеров Советский патент 1983 года по МПК G01N33/48 C07K1/14 A61K38/00 C12R1/38 C12R1/63 

Изобретение относится к медицине, а более конкретно к биохимическим методам исследования, и может быть иопользовано при разделении низкомолекуляр1ых и высокомолекулярных иммуноло- гическа активньос веществ. Известны способы разделения соединений различной молекулярной массы путем диализа через материалы с опре деленным диаметром пор: целлофан, кол- лодиевая пленка tl Однако этот способ продолжителен по времени и требует подбора материала с определенным размером пор в каждом конкретном случае. Наиболее близлим к предлагаемому является способ разделения биополимеров (например, холерогена) путем гельфильтрации через биогель Р-150 (полиакриламицный гель), включающий нанесе- ние разделяемой смеси на колонку с гелем и элюдию фракций. Для этого сухой порошок геля {биогель, акрилекс, ультра гель и др.) заливают буферным растворо и оставляют набухать. Через сутки на- бухший гель промывают пять раз буфером. Предварительно смонтированную колонку.заполняют гелем и промь1вают буфером в течение 12 ч. Исходный мате риал наносят на столбик геля и разделение биополимеров проводят при постоянно скорости потока элюирукнцего раствора и регистрации содержания биополимеров в элюате, который собирают с помощью кол- лектора отдельными фракциями одинаковог объема. Фракции, содержащие один и тот ж биополимер, объединяют и концентрируют. Весь процесс разделения занимает 48-5О ч 2 . Недостатки способа - неполное разде ление из-за ограниченного по размерам пор набора выпускаемых гелей и значительное разведение материала в процесс гель-фильтрации, что требует последующего концентрирования. Кроме того, воспроизводимые результаты разделения биополимеров методом гель-фильтрации могут быть получены лишь при наличии специального автоматизированного оборудования и высококвалифицированного персонала. Метод гель-фильтрации требует значительного времени на подготов ку геля, приготовление колонки, нанесение образца, проведение элюции, сбор фракций и их анализа. Цель изобретения - повьшение полноты разделения биополимеров и степени ксжцентрирования фракций, а также сох- ранение нативности биополимеров. Указанная цель.достигается тем, что согласно способу разделения биополимеров, предусматривающему контактирование разделяемой смеси биополимеров с полиакриламидным гелем и элюцию низко, молекулярной фракции биополимеров, разделяемую смесь биополимеров предварительно вводят в контакт со смесью исходньсс акриламидных сомономеров, инициаторов полимеризации и органического растворителя и осуществляют полимеризацию геля в присутствии биополимеров, полученный гель отделяют от реакционной среды и элюируют низкомолекулярную фракцию. При этом с целью сохранения нативности биополиь еров в качестве органического растворителя при синтезе геля иопользуют н-гептан. В качестве смеси биополимеров обьмно используют фильтрат культуры Vibno choBei ote 569 В, содержащий холероген и О холерный антиген и для полимеризации используют смесь, содержащую акриламидные сомономеры в количестве 7,5% при концентрации поперечносшивающего сомономера 25%. В качестве смеси биополимеров используют также препарат аллергена- кокцидиоидина из Cocci olio ides Immitis и для полимеризации используют смесь, содержащую акриламидные сомономеры в количестве 15% при койцентрации попе- речносщивающего сомономера 25%. В качестве смеси биополимеров используют культуральный фильтрат PseudOmondS pseuclomaeCei и для полимеризации используют смесь, соце жащую акриламидные сомономеры в количестве 10% при концентрации поперечносщивакяцего сомономера 25%. Биополимеры (обычно белково-липополисахаридной природы с различной молекулярной массой) включают в сетчатую структуру полиокриламидных грануа, а размеры пор геля подбирают в соответствии с молекулярной массой таким образом, чтобы низкомолекулярные биополимеры могли элюироваться, а высокомолекулярные - оставаться внутри гранул. Ускорение разделения биополимеров происходит за счет увеличения площади поверхности геля, т.е. при приготовлении сферических частиц полиакриламидного геля размером 100-150 мкм. Улучшение разделения достигается включением разделяемого материала за счет приготовления геля с заданным размером пор, что позволяет включать до 95+3% иоходного материала. Процесс разделения занимает 8-10 ч. Для приготовления гранул геля, оцнороцных по размерам, процесс полимеризации п-ровоцят при послецовательном введении инициаторов: сначала персульфата аммония, затем Ы,Ы N N -тeтpaмeтилэтилeндиaминa. Сохранению нативности биополимеров в процессе приготовления гранул геля способствует применение в качестве органической среды Н-гептана. В результате разделения низкомоле- кулярные биополимеры находятся в элюате, а высокомолекулярные биополимеры находятся в гранулах, которые в дальне шем. используются в. качестве иммуносор .бейтов для адсорбции иммунных сыворот Пример 1. Разделение холерогена и О антигена Vibrio сЪоБегае. В 9 мл раствора холерогена- :ырца (фильтрат бульонной культуры V. cfioEerde 569 В с содержанием белка до 2 мг/мл) растворяют навески сомонрмеров; акриламида 1,5 г и N, М-метиле бисакриламида 0,5 г. Общая койцентрация геля 7,5%, концентрация поперечносшивающего сомономера по отношению к общей 25%. Катализатор - 100 мг персульфата аммония - растворяют от дельно в 1 мл О,1 М фосфатного буфера рЛ 7,2 с 0,15 М хлористым натрием Оба раствора дегазируют в вакууме 1О ми В 10О мл Н -гептана растворяют 0,25 эмульгатора СПЭН- 85, смесь переносят в сосуд для полимеризации и продувают газообразным азотом 5 мин. Эмульгирование водной фазы в орган ческой и последующую полимеризацию осуществляют в колбе при перемешивани на электрической мешалке (300500 об/мин) в атмосфере азота. Вначал в течение 1 мин перемешивают органическую фазу с эмульгатором, затем сме шивают дегазированные водные раство1Й.1 сомономеров и катализатора и, не прекращая перемешивания органической фазы, медленно выливают водную фазу в сосуд для полимеризации. После двухминутного перемешивания к образовавшейся эмульсии воды в масле добав,ляют 1ОО мкл N, N,N, N- тетраметилэ лендиамина (ТЭМЭД). Полимеризация про исходит в течение 15-20 мин, об ее заве шении судят по резкому помутнению эмульсии и обнаружению -при световой микроскопии желтоватых сферическюс частиц диаметром 150-200 мкм. Образовавшуюся BSEtecb гранул отделяют от органической фазы, холероген элюируют уфером в течение суток при перемешивав ИИ. Холероген характеризуют по содержанию белка и углеводов, а также по биологической и серологической активноти. В табл. 1 представлена характеристика холерогена исходного фильтрата,полученного по предлагаемому способу и прототипу. Как следует из табл. 1, предлагаемый способ в отличие от прототипа позволяет разделить холероген (М М 840ОО а.е.) и О антиген (М М ЮОООО-ЗООООО а.е.) что подтверждено результатами реакций непрямой гемагглютинации с О-холерной агглютинирующей сывороткой и преципитации в геле. Пример 2 . Разделение аллергена и высокомолекулярного полисахарида возбудителя кокцидиоидоза.. Аллерген - кокцидиоидин (25 мг препарата антигена), полученный из Cocctdioides immftis 36-Сильвейра известным способом СзД , растворяют в 5 мл буфера и готовят ПААГ-гранулы по вышеописанной методике. Концентрация геля составляет: общая 15%, поперечносшиван щего сомономера 25%. Аллерген характеризуют по содержанию белка и углеводов, а также по биологической и иммунохимической активности. В табл. 2 дана характеристика аллерм гена-кокциаиоидина исходного, полученного предлагаемым способом и прототипу. Как сцеаует из табл. 2, предлагаемый способ в отличие от прототипа позволяет разделить аллерген (М М 12ООО2ОООО а.е.) и высокомолекулярный полисахарид (М М 60ООО-4ООООО а.е.), что подтверждено результатами реакции им- мунодиффузии в геле. Пример 3 . Разделение токсина и термостабильного гликопротеидного антигена возбудителя мелиоидОза. В ПА А Г гранулы включают культураль ный фильтрат Pseucfemonois pseuclomc Geei (1,2 мг белка в мл). Концентрация геля составляет: общая 10%, поперечносшивающего сомономера 25%. Разделение токсина проводят по описанной вьш1е методике. Токсин характеризуют по содержанию белка и углеводов, а также по биологической и иммунохимической активности. В табл. 3 дана характеристика термолабильного мелиоиаозного токсина исходного, полученного по предлагаемому способу и прототипу. 10 Как следует из табл. 3, предлагаемый способ Б отличив от прототипа позволяет разделить мелиоидозный токсин (М М ЗОООО а.е.) и термостабильный антиген ( М М 750000 а.е.), что поцтверждено результатами реакции иммуноаиффузии в геле. Изобретение по сравнению с известным способом позволяет более эффективно разделять биополимеры вследствие полного (до 95%) включения внутрь геля. исходного матер1юла, возможности приготовления геля с заданными размерами 18 пор, что обеспечивает иммобилизацию высокомолекулярных примесей и элюцию интересующих биополимеров, проведения элюции небольшими объемами, что сни-, жает степень р 1збавления полученных препаратов и позволяет отказаться от последующего концентрирования, значительного сокращения (в Ф-5 раз) времени разделения биополимеров. Для проведения разделения биополимеров предлагаемым способом не требуется сложной аппаратуры и высококвалифицированного персонала. Таблица 1

1. СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ . БИОПОЛИМЕРОВ, предусматривающий контактирование разделяемой смеси биополимеров с полиакриламидным гелем и элюцию низкомолекулярной фракции биополимеров, отлича ющийся тем, что, с целью повышения полноты разделения и степени концентрирования фракций, разделяемую смесь биополимеров прецваригельно вводят в контакт со смесью исходных акриламидных сомономеров, инициаторов полимеризации и органического растворителя и осуществляют полимеризацию геля в присутствии биополимеров, полученный гель отделяют от реакционной среды и элюируют низкомопекулярную фракцию. 2.Способ по п. 1, отличающий с я тем, что, с целью сохранения нативности биополимеров, в качестве органического растворителя при синтезе геля используют н-гептан. 3.Способ по пп. 1и2,отличающийся тем, что в качестве смеси биополимеров используют фильтрат культуры Vibrio 569 В, содержащий холероген и О холерный антиген и для полимеризации используют смесь, соде{ жащую акриламидные сомономеры в количестве 7,5% при концентрации поперечноi сшивающего сомономера 25%. (Л 4.Способ по пп. 1 и2, отличающийся тем, что в качестве смеси биополимеров используют препарат аллергена-кокцидиоидина из Coccidioides immitis и для полимеризации используют смесь, содержащую акриламидные сЬмономеры в количестве 15% при концентрации поперечносщивающего сомономера 25%. 00 5.Способ по пп. 1 и 2, о т л и ч аел ел ющийся тем, что в качестве смеси биополимеров используют культуральный фильтрат PseucJomonoiS peeudomotCeei и 00 для полимеризации используют смесь, содержащую акриламидные сомономеры в количестве 10% при концентрации поперечносщивающего сомономера 25%.

5

1:1024 1О

1:512нет

1:64 40

1,25

0,9

0,1 0,86

0,1

0,18

1:4

Исходный фильтрат

1:6

15 1:8

60 1:1

ТабпицаЗ

10,861,2

О0,190,4