Способ количественного определения в зерне и зерновых продуктах 4,15-диацетокси-8-(3-метилбутирилокси)-12,13-эпокситрихотецена-3-ол Советский патент 1989 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к микробиологическим исследованиям токсиново

Цель изобретения - повьшение чувствительности способа определения 4,15-диацетокси-8-(3-метилбутирил- окси)-12,13-эпоксит ихотецена-З-ол путем.снижения предела обнаружения минимальных количеств микотоксина.

Способ заключается в экстракции образца, нанесении экстракта исследуемой пробы на хроматографическую пластинку, последующей ее хроматографии, обнаружении токсина с помощью специфической культуры дрожжей. Параллельно с хроматографией образца хроматографируют ряд последовательно нанесенных пятен стандартного раствора микотоксина с содержанием токсина в пятне 0,015; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,07; 0,1 мкг. Обе пластинки заливают агаризованной средой с внесенным в нее стандартизированным количеством 0,8-1-10 в 1 мл дрожжевых клеток штамма Saccharomyces lactir, BKMY-459, инкубируют пластинки, определяют наименьшее количество исследуемого образца наименьшее количество стандартного чистого микотоксина, при котором образуется зона задержки рос- та дрожжей с Rf образца, равным Rf чистого микотоксина.

Выбор количества чистого токсина при хроматографировании определяется чувствительностью культуры дрожжей. Выбор стандартизованного количества дрожжевых клеток в агаризованной среде 0,8-1-10 (1 мл среды, обеспечивает такую Плотность засева среды, при которой образуются четкие зоны задержки роста дрожжей при низких количествах микотоксина в пятне на хро- матограмме).

Использование не применяемого ранее для выявления Т-2 токсина штам- ма дрожжей Saccharomyces lactis BKMY- 459 повышает чувствительность способа на 30-40%.

Способ осуществляют следующим образом.

Измельченное зерно ржи, пшеницы и других зерновых культур, или зерно- продукты экстрагируют хлороформом. Отфильтрованный экстракт упаривают до полного удаления хлоро форма, остаток растворяют в определенном объеме хлороформа, наносят на хроматогра- фические пластинки с тонким закреп- ,ленным слоем силикагеля последовательно ряд пятен образца в количест- ве 1,3,5,7,10,12,15 мкл и ряд пятен раствора Т-2 токсина в количестве 0,015; 0,02,- 0,03; 0,04; 0,05; 0,07; 0,1 мкг, хроматографируют пластинки в системе бензол-ацетон 3:2, высушива- ют и заливают сусло-агаром, в кото- рьй внесен на 10 .мл агара 1 мл суспензии односуточной культуры дрожжей Saccharomyces lactis BKMY-459, содержащей 8«10 клеток в МП. (10 еди- ниц по стандарту мутности), инкубируют пластинки во влажной камере 18-20 ч при 26-28°С, определяют наименьший объем исследуемого образца и наименьшее количество чистого токси- на Т-2, вызывающие образование на хр матограмме зон задержки роста дрожже с Rf образца, равным Rf раствора чистого микотоксина, рассчитывают количество микотоксина Т-2 (X) в испыту- емом образце по формуле

..

Б.Г

5 5 0 S

0

где А - наименьшее количество микотоксина Т-2, которое вызывает образ звание зон задержки роста дрожжей на хроматограм- ме, мкг;

Б - масса исследуемой пробы продукта, г; В - объем экстракта исследуемой

пробы, мкл;

Г - наименьшее количество экстракта исследуемой пробы, которое дает задержку роста дрожжей на хроматограмме, мкл. П р и м е .р 1. 50 г измельченного зерна экстрагируют 200 мп хлороформа. Экстракт фильтруют, выпаривают в токе воздуха до полного удаления хлороформа, остаток растворяют в. 5 мл хлороформа, наносят последовательно в количествах 1,3,5,7,10,12, 15 мкл на хроматографические пластинки. В качестве вещества-свидетеля наносят на те же пластинки 2 мкл чистого раствора Т-2 токсина в хлороформе 0,05 мкг/мкл. На другие хроматографические пластинки наносят последовательно пятна раствора чистого Т-2 токсина с количеством микотоксина в пятне 0,015; 0,02; 0,03; 0,04; 0,0i; 0,07; 0,1 мкг. Пластинки хроматографируют в системе бензол-ацетон 3;2 и высушивают. Далее проводят 4 варианта опыта для доказательства преимущества предлагаемого способа.

Вариант 1. На поверхность пластинок наносят расплавленный и охлажденный до 50°С сусло-агар, в кото- рьА предварительно вносят суспензию клеток односуточной культуры дрож- шей штамма Saccharomyces lactis BKMY-459 в стерильном физиологическом растворе в количестве 8-10 клеток на 10 мл агара (1 мл суспензии клеток, мутность которой соответствует 10 единицам стандарта мутности, на .10 МП сусло-агара). Пластинки вьдерживают во влажной камере при 28 С 18 ч, после чего учитывают характер роста штамма BKMY-459. Наличие зоны угнетения роста дрожжей на хроматограмме с нанесенным исследуемым образцом с центром в точке, Rf которой равен Rf зоны, вызванной веществом-свидетелем, указывает на наличие в образце продукта микоток- снна Т-2,

Наименьшее количество образца, при котором наблюдается образование

зоны задержки роста дрожжей на хро- матограмме Г, 7 мкл. Наименьшее количество чистого токсина Т-2, вызывавшее образование зоны задержки роста дрожжей на хроматограмме А, 0,02 мкг. Количество микотоксина Т-2 (X) в испытуемом образце зерна рассчитывают по формуле (А 0,02 мкг Б 50 г, В 5000 мкл, Г 7 мкл)

Х 2 22 ьЕ 15000 мкл мкг/ 50 г 7 мкл

Вариант П. На поверхность пластинок наносят расплавленный и охлаж- данный до 50 С сусло-агар, в котот рый предварительно вносят суспензию клеток односуточной культуры йтамма Candida pseudotrop,icalis 44 пк. Нанесение культуры на хроматограмму осуществляют по предлагаемому способу аналогично варианту 1 для сопоставимости чувствительности культур. Культуру вносят в стерильном физиологическом растворе в количество 8-10 клеток на 10 мл агара (1 мп суспензии клеток, мутность которой соответствует 10 единицам ставдарта мутности, на 10 мп сусло-агара). Пластинки выдерживают во влажной камере при 28°С 18 ч, после чего учи тьшают характер роста,штамма 44 пк., как в варианте 1,

Наименьшее количество образца, при котором наблюдается образование зоны задержки роста дрожжей.на хроматограмме Г, 12 мкл. Наименьшее количество чистого токсина Т-2, вызвавшее образование зоны задержки роста дрожжей на хроматограмме А, 0,03 мкг. Количество микотоксина Т-2 (X) в испытуемом образце зерна рассчитьшают по формуле (А 0,03 мк Б 50 г, В 5000 мкл, Г 12 мкл).

0,03 мкг 5000 мкл ,, „ , X -. 0,25 мкг/

50 г 12 мкл

Вариант, III. На поверхность штас- тинок наносят расплавленньй и охлажденный до 50 с сусло-агар, в который внесены клетки односуточной культуры дрожжей Saccharomyces lactis BKMY- 459 в количестве О, в 1 мл, т.е. в 10 раз меньше рекомендуемого. Пластинки вьщерживают во влажной ка- мере при 28 С 18 ч, после чего учитывают характер роста штамма ВКМУ-459. При таком количестве дрожжвых клеток в агаре четкие зоны за

д

5 0 5 о

Q

, 5

0 5

5

держки роста дрожжей не выявляются, культура дрожжей растет в агаре в виде отдельных точечных колоний.

Вариант УУ. Выполняют аналогично варианту I, но вносят в сусло-агар 1 10 дрожжевых клеток в 1 мл, т.е. в 100 раз больше рекомендуемого. Пластинки выдерживают при 28 с 18 ч, после чего учитывают характер роста штамма ВКМУ-459, как в варианте t. При таком количестве дрожжевых клеток в агаре на хроматограмме с нанесенным экстрактом исследуемого образца зерна зоны задержки роста дрожжей не выявляются. Наименьшее количество чистого токсина Т-2, вызывавшее образование зоны задержки роста дрожжей на хроматограмме А, .0,05 мкг.

Из приведенного примера видно, что предлагаемый способ определения 4,15- диацетокси-8-(3-метилбутирилокси)- 12,13-эпокситрихотедена-З-ол (микотоксина Т-2) с использованием культуры дрожжей Saccharomyces lactis BKMY-459 позволяет обнаружить на хроматограмме до 0,02 мкг микотоксина в пятне, тогда как применение штамма Candida p seudotropicalis 44 пк (при проведении всех остальных приемов анализа зерна аналогично предлагаемо- му способу) позволяет обнаружить на xpoMaTorpaMi-ie до 0,03 мкг микотоксина в пятне. Таким образом, только за - счет использования штамма Saccharomyces lactis BKMY-459 на 30-40% повышается чувствительность способа

определения микотоксина.

I

Формула изобретения

Способ количественного определения в зерне и зерновых продуктах 4,1 5-дйацетокси-8- (3-метилбутирилокси)-12, 13-эпокситрихотецена-З-ол, предусматривающий экстракцию, нанесение экстракта исследуемой пробы на хроматографическую пластинку, последующую ее хроматографию, обнаружение микотоксина с помощью специфической культуры дрожжей, отличающийся тем, что, с целью повьш1е- ния чувствительности способа, параллельно с хроматографией экстракта хроматографируют ряд пятен стандартного раствора микотоксина с содержанием его 0,015-0,1 мкг в пятне, обе пластинки заливают агаризованной средой с внесенным в нее стандартизованным количеством дрожжевых кле714244948

ток 0,. на 1 мл штамма Saccha-при котором на хроматограммах обраromyces lactis BKMY-459, определяютзуются зоны задержки роста дрожжей

наименьшее количество стандарта ми-с Rf образца,.равным Rf чистого микокоток сина и исследуемого образца,j- токсина.

И зобретение относится к микробиологии, а именно к микробиологическим исследованиям токсинов. Целью изобретения является повьппение чувствительности способа определения 4,15-диацетокси-8-(3-метилбутирилок- си)-12,13-эпокситрихотецена-З-ол пу- тем снижения предела обнаружения минимальных количеств микоток ина. Изобретение позволяет повысить чувствительность определения 4,15-диацеток- си-8-(3-метилбутирилокси)-12,13-эпок- ситрихотецена-3-ол (микотоксина Т-2) микробиологическим методом. Применяют для обнаружения пятен микотоксина на хроматографической пластинке специфическую чувствительн ао культуру дрожжей Saccharomyces lactis BKMY- .459, параллельно с хроматографией образца хроматографируют ряд последовательно нанесенных пятен стандартного раствора микотоксина с содержанием его 0,015-0,1 мкг, используют для заливки хроматографических пластинок после хроматографии сусло-агар с внесенным в него стандартнаирован- ньм количеством дрожжевых клеток 0,8-1 10 в мл., определяют количество токсина Т-2 в исследуемом образце по наименьшему количеству стандарта токсина и иследуемого образца, при котором на хроматограммах образуются зоны задержки роста дрожжей с Rf образца, равным Rf чистого шшотоксина. W