СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ ЖИДКОГО ЭКСТРАКТА АЛОЭ ВЕРА Российский патент 2023 года по МПК A61K36/886 G01N11/02 A61P31/04 

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, и может быть использовано в эксперименте in vitro. Экстракт алоэ относится к средствам растительного происхождения. Алоэ обладает противовоспалительным действием, усиливает процессы регенерации слизистых оболочек и кожи. Различные химические компоненты алоэ в зависимости от дозы могут оказывать цидное или статическое действие в отношении различных видов патогенных микроорганизмов. Экстракт алоэ ингибирует рост Helicobacter pylori путем уменьшения активности ариламин N-ацетилтрансферазы. Показано, что эмодин обволакивает вирусы, что приводит к их инактивации, и оказывает прямое вироцидное действие на вирусы Herpes simplex типов 1 и 2, Varicella zoster и вирусы гриппа. Сок алоэ, консервированный спиртом, оказывает бактерицидное действие на кокковую флору, возбудителей кишечных инфекций, возбудителей дифтерии, коклюша, микобактерий туберкулеза. Антимикробная активность алоэ древовидного и алоэ вера подтверждена методом прямой диффузии в 1,5 % агаровый гель, содержащий 10% раствор гидроксида калия в качестве индикатора в отношении тест-культур Грам+ и Грам- микроорганизмов видов Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Escherichia coli [1].

Известны способы повышения биоцидной активности химических композиций в отношении широкого спектра микроорганизмов при изменении концентрации действующих веществ, рН среды и использовании органических кислот. Комбинации ацилированных аминокислот или ацилированных пептидов с неэтоксилированными поверхностно-активными веществами при конкретных значениях pH в относительно низких концентрациях приводят к высокой антимикробной активности без появления повреждающего действия для множества обрабатываемых поверхностей и без токсического действия на кожу и слизистыеоболочки человека [RU 2 712 186 C1]. Для повышения антимикробной активности предпочтительным в составе композиций является наличие по меньшей мере одной из карбоновых кислот: молочной кислоты, гликолевой кислоты, бензойной кислоты и винной кислоты, которые должны составлять не менее 50 масс.% относительно общего содержания карбоновых кислот в системе с pH композиции в диапазоне 1-5.

Техническим результатом настоящего изобретения является разработка способа повышения антимикробной активности жидкого экстракта алоэ при использовании лекарственного препарата in vitro путем послойного нанесения растительного препарата и аморфного гидрогеля, предотвращающее высыхание и пролонгирующее антимикробное действие жидкого экстракта алоэ.

Для решения поставленной задачи был выполнен эксперимент на 25 штаммах Staphylococcus aureus, выделенных с раневой поверхности у морских свинок (Таблица 1) и 20 штаммах Escherichia coli (Таблица 2). Оценку антимикробной активности проводили в соответствии с ОФС.1.2.4.0010.18 Определение антимикробной активности антибиотиков методом диффузии в агар.

Для оценки антимикробной активности жидкого экстракта алоэ в стерильные пластмассовые чашки Петри размером 12х83 мм, установленные строго на горизонтальной поверхности разливали расплавленный агар Мюллер-Хинтона (I) в 2 слоя. Для нижнего слоя использовали стерильную незасеянную питательную среду, для верхнего слоя - стерильную питательную среду, предварительно засеянную тест-штаммами микроорганизмов, выделенными из исследуемого материала в количестве 10⁸КОЕ/мл, обеспечивающее оптимальный рост исследуемых культур и четкость зон угнетения роста микроорганизмов. Оптимальное количество посевной дозы определялось опытным путем на основании формирования четкой зоны угнетения роста тестируемого микроорганизма, которая должна превышать диаметр цилиндра для внесения лекарственного препарата. Стерильные цилиндры единого размера и массы высотой 10,0+0,1мм внутренним диаметром 5,0+0,1 мм из нержавеющей стали в количестве 6 штук размещали на поверхности верхнего слоя агара на одинаковом расстоянии друг от друга и края чашки. Для определения антимикробной активности жидкого экстракта алоэ вера использовали трехдозный вариант метода диффузии в агар. Для этого 3 одинаковых объема жидкого экстракта алоэ вера по 200 мкл - контрольный раствор (К1, К2, К3) вносили в цилиндры установленные на поверхности питательного субстрата каждой чашки, в другие 3 цилиндра этой же чашки вносили такие же объемы жидкого экстракта алоэ 200 мкл, на которые сверху вторым слоем наносили аморфный гидрогель для ран – испытуемый раствор (И1, И2, И3) в количестве 100 мкл. После внесения испытуемых растворов для уменьшения колебаний во времени между внесением препаратов, используемых в опыте, выдерживали их в цилиндрах при комнатной температуре в течение 1-2 часов. Чашки инкубировали в термостате при t+37°С в течение 24 часов. Диаметры зон угнетения роста тестируемых микроорганизмов измеряли с точностью до 0.1 мм. Далее вычисляли среднюю величину зон подавления роста контрольными и испытуемыми растворами. По разности между средней величиной контрольного и испытуемого растворов определяли изменение антимикробной активности жидкого экстракта алоэ.

Таблица 1 . Определение антимикробной активности жидкого экстракта алоэ и композиции жидкого экстракта алоэ и аморфного гидрогеля по отношению к Staphylococcus aureus.

№ п/п Диаметр зон задержки роста, мм
(жидкий экстракт алоэ, К1, К2, К3) Диаметр зон задержки роста, мм
(композиция жидкого экстракта алоэ и аморфного гидрогеля И1, И2, И3) 1. 19,5 + 0,32 20,4+ 0,35 2. 17,7 + 0,52 18,4+ 0,55 3. 18,3+ 0,14 18,9+ 0,11 4. 20,5 + 0,22 20,7+ 0,29 5. 16,7 + 0,31 17,3+ 0,34 6. 19,4+ 0,42 19,9+ 0,47 7. 19,2+ 0,12 20,4+ 0,14 8. 18,7+ 0,62 18,9+ 0,63 9. 19,1+ 0,42 19,9+ 0,39 10. 19,5 + 0,21 21,1+ 0,19 11. 18,3+ 0,34 19,5+ 0,35 12. 18,1+ 0,50 18,8+ 0,58 13. 19,8+ 0,24 19,8+ 0,21 14. 16,9+ 0,46 17,4+ 0,39 15. 17,4+ 0,48 18,9+ 0,42 16. 19,6+ 0,33 19,8+ 0,35 17. 19,1+ 0,25 20,3+ 0,21 18. 17,9+ 0,49 20,8+ 0,52 19. 18,4+ 0,23 19,3+ 0,24 20. 18,9+ 0,41 18,9+ 0,49 21. 17,3+ 0,23 17,5+ 0,19 22. 20,5 + 0,29 21,8+ 0,21 23. 19,6+ 0,47 20,4+ 0,41 24. 19,6+ 0,35 20,3+ 0,32 25. 18,8+ 0,34 19,5+ 0,39

Таблица 2. Определение антимикробной активности жидкого экстракта алоэ и композиции жидкого экстракта алоэ и аморфного гидрогеля по отношению к Escherichia coli.

№ п/п Диаметр зон задержки роста, мм
(жидкий экстракт алоэ, К1, К2, К3) Диаметр зон задержки роста, мм
(композиция жидкого экстракта алоэ и аморфного гидрогеля И1, И2, И3) 1. 18,2 + 0,31 20,2 + 0,31 2. 14,7 + 0,42 17,6 + 0,42 3. 16,3+ 0,11 18,4+ 0,11 4. 19,5 + 0,24 20,7 + 0,24 5. 17,3 + 0,32 19,2 + 0,32 6. 20,4+ 0,39 22,3+ 0,39 7. 21,2+ 0,14 23,1+ 0,14 8. 19,8+ 0,51 21,5+ 0,51 9. 19,9+ 0,44 22,4+ 0,44 10. 21,4 + 0,19 24,3 + 0,19 11. 19,4+ 0,35 22,6+ 0,35 12. 19,9+ 0,52 23,7+ 0,52 13. 21,3+ 0,19 24,4+ 0,19 14. 18,1+ 0,43 21,1+ 0,43 15. 19,3+ 0,45 22,8+ 0,45 16. 19,9+ 0,38 23,7+ 0,38 17. 20,1+ 0,14 24,1+ 0,14 18. 19,3+ 0,45 22,3+ 0,45 19. 19,8+ 0,25 23,7+ 0,25 20. 21,3+ 0,31 24,2+ 0,31

Принцип диффузионного метода (по Keurby-Bauer) основан на феномене ингибиции антимикробным веществом поверхностного, видимого роста микроорганизмов на плотной (агаровой) питательной среде. Способ, основанный на диффузии веществ в питательный агар является одним из наиболее часто применяемых методов определения активности антимикробных препаратов. Оценка активности антимикробных препаратов данным методом проводится по диаметру зоны подавления роста инокулированного на поверхность питательного субстрата микроорганизма. В результате диффузии жидкого экстракта алоэ вера из носителя (цилиндра) создается градиент концентрации вещества в питательной среде. В точке, где минимальная концентрация вещества станет равной минимальной подавляющей концентрации (МПК) вещества в отношении исследуемого микроорганизма рост микроорганизма будет подавлен.  

Как показано в таблицах, антибактериальное исследование послойного нанесения жидкого экстракта алоэ и аморфного гидрогеля показало увеличение зон задержки роста культуры стафилококка и эшерихий растительным лекарственным средством. Средняя величина зон подавления роста стафилококка жидким экстрактом алоэ (контрольный раствор) равна 18,75+ 0,35. Средняя величина зон подавления роста микроорганизмов композицией жидкий экстракт алоэ и аморфный гидрогель (испытуемый раствор) равна 19,56+ 0,35.

Средняя величина зон подавления роста эшерихий жидким экстрактом алоэ (контрольный раствор) равна 19,36 + 0,33. Средняя величина зон подавления роста эшерихий композицией жидкий экстракт алоэ и аморфный гидрогель (испытуемый раствор) равна 22,11 + 0,32.

На увеличение диаметра зоны подавления роста микроорганизмов влияют прежде всего стабильность химической формулы вещества и концентрация антимикробного вещества. Увеличение зоны задержки роста микроорганизма при послойном нанесении двух растворов – нижнего слоя жидкого экстракта алоэ, верхнего слоя аморфного гидрогеля для ран подтверждает наличие обеих указанных выше биологических характеристик жидкого экстракта алоэ вера.

Пограничные значения диаметров зон подавления роста микроорганизмов коррелируют с пограничными значениями минимальных подавляющих концентраций антимикробных веществ, что позволяет прогнозировать отношение тестируемых микроорганизмов к антимикробным препаратам как чувствительные или устойчивые. Например, зона задержки роста тестируемого микроорганизма вокруг диска с ампициллином 13 мм и менее коррелирует с МПК антибиотика равной 32 мкг\мл и более; зона задержки роста – 14-16 мм коррелирует с МПК - 16 мкг\мл.Фармакокинетические/фармакодинамические закономерности зависимости между величиной МПК антимикробного препарата в отношении микроба-возбудителя и зоной задержки роста используются в том числе и для фармакокинетических характеристик препарата [2].

Таким образом, послойное нанесение двух растворов – нижнего слоя жидкого экстракта алоэ вера, верхнего слоя аморфного гидрогеля для ран позволяет повысить антимикробную активность экстракта алоэ вера.

Литература

1. Глущенко С.Н. Сравнительное фармакогностическое исследование листьев и побегов Алоэ древовидного (ALOE ARBORESCENS MILL.) И Алоэ Вера (ALOE VERA L. EX WEBB). Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук. - Самара – 2021. – 167 с.

2. Клинические рекомендации. Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам. Версия-2018-03. – 206 с.

Изобретение относится к фармакологии, а именно к способу повышения антимикробной активности жидкого экстракта алоэ вера в эксперименте in vitro в отношении Staphylococcus aureus и Escherichia coli. Способ повышения антимикробной активности жидкого экстракта алоэ вера в эксперименте in vitro в отношении Staphylococcus aureus и Escherichia coli включает внесение в стерильные цилиндры из нержавеющей стали, установленные на поверхности питательного субстрата чашки Петри, поверх жидкого экстракта алоэ в количестве 200 мкл аморфного гидрогеля для ран в объеме 100 мкл с последующим выдерживанием чашки Петри при комнатной температуре в течение 1-2 ч с дальнейшей инкубацией в термостате при t +37°С в течение 24 ч. Вышеописанный способ позволяет повысить антимикробную активность жидкого экстракта алоэ вера в эксперименте in vitro в отношении Staphylococcus aureus и Escherichia coli. 2 табл.

Способ повышения антимикробной активности жидкого экстракта алоэ вера в эксперименте in vitro в отношении Staphylococcus aureus и Escherichia coli, включающий внесение в стерильные цилиндры из нержавеющей стали, установленные на поверхности питательного субстрата чашки Петри, поверх жидкого экстракта алоэ в количестве 200 мкл аморфного гидрогеля для ран в объеме 100 мкл с последующим выдерживанием чашки Петри при комнатной температуре в течение 1-2 ч с дальнейшей инкубацией в термостате при t +37°С в течение 24 ч.