Олигомер урокиназы,обладающий фибринолитическим действием,и способ его получения Советский патент 1986 года по МПК C08H1/02 

Изобретение относится к олигомерным формам протеазыурокиназы общей формулы ((СНг) Y остаток урокиназы; И 2-3; Ьп 1-2, ММ 65 403-96 10, способам получения олигомерных фор сохраняющих ферментативную активность, и может найти широкое применение в лабораторной практике для модельных экспериментов. Известен продукт, полученный способом крвалентной иммобилизации урокиназы на карбоксиметилцеллкшоз гидразиде. Способ получения этого продукта включает следукнцие технологические операции: .0,5 г карбокси«етилцеллюлозагид разида суспендируют в 75 мл 0,5 М раствора NaCZ и перемешивают 15 мин; . к суспензии добавляют 5 мл 5%-н го раствора NaNOj и перемешивают 20 мин; вьшавший азид отделяют центрифу гированием, осадок промывают 1 М раствором VlaCi, и бикарбонатным буферным раствором; осадок суспендируют в растворе урокиназы в бикарбонатном буфере; рН -суспензии доводят до 8,5 и перемешивание ведут 12ч пр;и , затем промывают водой и бикарбонат ным буферным раствором; все операции проводят при охлаж дении с предварительно охлажденными реагентами, продукт реакции суспензия иммобилизованной протеазы - хранится при охлаждении. Полученная иммобилизованная уро киназа стабильна при в течение 6 месяцев, за это время она сохраняет 55% исходной активности. Основным недостатком известного способа является получение продукт с низкой (1%) специфической актив ностью и нерастворимостью. Целью изобретения является полу чение водорастворимых форм урокина повьшение специфической фибринолит ческой активности. 4 Поставленная цель достигается олигомером. урокиназы общей формулы ,(Y)-foc- CH2b-oi где Y - остаток урокиназы; h 2-3; hi 1-2, MM 65-10 -96-10. Указанный олигомер является новым, в литературе не.описан. Способ получения олигомера урокиназы общей формулы (СНг)гО-Ь где - остаток урокиназы; h 2-.3; Ьл 1-2, ММ 65.10 -96-103, обладающего фибринолитическим действием, заключается в том, что урокиназу растворяют в О,10-0,15 М фосфатном буфере, затем в раствор Последовательно вводят глутаровый диальдегид при соотношет НИИ урокиназы и диальдегида 5:0, и 4,0-4,5%-ный водный раствор тригидроксиметиламинометана, а целевой продукт ввделяют гель-хр(1атографией. Способ осуществляют следующим образом. Урокиназу с активностью 1000 ед Плоуга/мг растворяют в О,10-0,15 М фосфатном буферном растворе с рН 6,0-6,2 и добавляют 2,02,2%-ньй водный раствор глутарового. диальдегида. Смесь перемешивают при 20-22с 10-360 мин при соотношении урокиназы и глутарового диальдегида 5:1,0-1,1. В реакционную смесь добавляют 4,0-4,5%-ный водный раствор тригидроксиметиламинометанаПолученный раствор с рН 6,0-6,2 гель-хроматографируют на сефадексе С-100, уравновешенном 0,10-0,15 М фосфатньв 1 буферньы раствором с рН 6,0-6,2. Элюцию ведут тем же буферным раствором. Биологическая активность олигомерной модификации урокиназы изучена при лечении экспериментальной гифемы животных. Пример 1. 10 мг урокиназы с активностью 1000 ед Плоуга/мг белка растворяют в 3 мл 0,10 М фосфатного буферного раствора с рН .

. 39

Медленно добавляют О,10 мл 2,2%-ного гяутарового.диальдегида при соотношении урокиназы и глутарового диальдегида 5:1,1. Смесь перемешивают 30 мин, при к ней добавляют 0,10 мл 4,5%-ного триоксиметиламинометана. Через 10 мин полученнзто смесь вводят в хроматографическую колонку.(1,5x150 см), заполненную 300 мл сефадекса С-100, уравновешенного 0,10 М фосфатньм буферным раствором с рН 6,0. Гель-хроматографию проводят при 5с со скоростью 15 мл/ч. Элюцию проводили О,10 М фосфатным-буферным раствором с рН 6,0.

Количество вьщеленной растворимой олигомерной урокиназы 6,0 мг, что составляет 60% от количества фермента, взятого в реакцию.

Пример 2. 10 мг урокиназы с активностью 1000 ед Плоуга/мг белка растворяют в 3 млО,15М фосфатного буферного раствора с рН 6,2. К полученному раствору добавляют 0,10 мл 2,0%-ного раствора глутарового диальдегида при соотношении урокиназы и глутарового диальдегида 5-: 1. Смесь перемешивают 120 мин при , добавляют 0,10 мл 4,0%-ного раствора триоксиметштаминометана. Реакционную смесь гельхроматографируют в условиях примера 1. Элюцию ведут со скоростью 20 МП/ч. Общее количество растворимой олигомерной урокиназы 7,6 мг, что составляет 76% от количества фермента, взятого в реакцию.

Пример 3. 10 мг урокиназы с активностью 10QO ед Плоуга/мг белка растворяют в 3 мл 0,10 М фосфатного буферного раствора с рН 6,0. К раствору добавляют 0,10 мл 2,0%-ного глутарового альдегида (соотношение урокиназы и глутарового альдегида 5:1). Смесь перемешивают 360 мин .при , добавляют 0,10 мл 4,5%-ного раствора триоксиметиламинометана После перемешивания в течение 10 мин при 22°С реакционную смесь гель-хроматографируют в условиях примера 1 при со скоростью элюции 15 мл/ч

Общее количество растворимой олигомерной урокиназы составляет 9,5 мг или 95% от количества фермента, взятого в реакцию. .

Пример 4. 50мг урокиназы с активностью 200 ед Плоуга/мг бел. 4 .

ка растворяют в 16 мл 0,05 М фосфатного буферного раствора с рН 6,0. К раствору добавляют 0,5 мл 2,2%-ного раствора глутарового альдегида.

Смесь перемешивают 60 мин при , добавляют 0,5 мл 4,4%-ного раствора триоксиметиламинометана. После перемешивания в течение 10 мин при 20 реакционную смесь вводят в колонку (3x80 см) с сефадексом С-100 для отделения олигомерных форм урокиназы от немодифицированного фермента. Элюцию ведут при 5С 0,1 М фосфатным буферным раствором со скоростью 20 мл/ч. Общее количество растворимой олигомерной урокиназы составляет 35 мг или 70% от количества фермента, ВЗЯТОГОв реакцию. Активность олигомерной урокиназы составляет 20% от исходной активности урокиназы.

Характеристики олигомерных фррм урокиназы приведены в табл. 1.

Таблица 1

Выход

Активность, %. к исходной урокиназе

тример,

высшие (ММ 96000) олигомеры (ММ 200000:

32/40

21/20 6/5

34/45 28/20. 14/10

38/50 36/15 21/5

Пример 5. 15 мг урокиназы . с активностью 1000 ед. Плоуга/мг белка растворяют в 5 мл О,1 М фосфатного буферного раствора с рНб,0. К полученному раствору добавляют 0,075 мл 2,2%-ного глутарового диальдегида (соотношение урокиназы глутарового диальдегида ). Смесь перемешивают 2.ч при 20С. Затем добавляют 0,075 мл 4,5%-ного триоксиметиламинометана. После перемешивания в течение 10 мин при реакционную смесь, гель-хроматографируют в условиях примера 1 при 5°С со скоростью элюции 15 мл/ч. .Общее количество растворимой олигомерной урокиназы составляет 9,9 мг иди 66% от количества фермента, взятого в реакцию: из них димер 29%, тример 31%, высшие олигомеры 6%.

Характеристики олигомерных форм урокиназы приведены в табл. 2.

Таблица

Димер (ММ65МО)

Тример

(ММ 96«10)

Высшие олигомеры

(ММ 200 Ч О)

Активность исходной и олигомерных форм урокиназы определяют по усовершенствованному методу Аструпа на фибриновых пленках.

Расчет активности проводят по калибровочной зависимости полученной для стандартной урокиназы с активностью 500 ед. Полуга на ампулу.

В качестве активных олигомерных форм используют смесь димеров и тримеров, отделяя высшие олигомеры, характеризующиеся пониженной биологической активностью.

При лечении экспериментальной гифемы терапевтический эффект при одно- или двукратном введении олигомерной активной формы урокиназы аналогичен терапевтическому эффекту при шестикратном введении мономерной урокиназы в эквивалентньк дозировках на одну инъекцию.

Это свидетельствует о cynjecTfioвании пролонгирования действия модифицированной олигомерной активной формы урокиназы.

1. Олигомер урокиназы общей формулы . (Y; -foc-(cH2)3-ot т Y - остаток урокиназы; где h 2-3; hr 1-2; MM 65-10 -96-103, обладающий фибринолитическим действием. 2. Способ получения олигомера урокиназы общей формулы (Y)(CH2)3-Oi«, где V - остаток урокинаэы; п 2-3; И1 1-2; ММ 65-103-9610, обладающего фибринолитическим действием, заключающийся в том, что урокиназу растворяют в О,10-0,15 М фосфатном буферном растворе, затем в § раствор последовательно вводят глутаровый диальдегид при массовом соотношении урокиназы глутарового диальдегида 5:0,55-1,, 1 и 4,0-5,4%-ный водный раствор тригидроксиметиламинометана, а целевой продукт вьщеляют гель-хроматографией. СО