Способ получения диагностикума Советский патент 1984 года по МПК A61K39/44 

11 Изобретение относится к области медицины, в частности к серологическим методам экспресс-диагностики кок пюша. До сих пор единственным методом ранней диагностики коклюша является бактериологическое исследование. Это объясняется тем, что в катаральный период болезни, который длится 2 недели, отмечается наиболее высокая высеваемость коклюшных бактерий, и больной в значительной мере опасен из-за отсутствия характерных клинических симптомов. Однако даже при проведении многократньйх бактериологических исследований купировать рас пространившуюся вспышку весьма затруд нительно. Последнее определяется тем что коклюшная палочка относится к медленно растущим микроорганизмам, поэтому результаты посевов становят известными не ранее чем через 4872 ч после взятия материала. За это время инфицированные дети с ещё неразвившимися клиническими симптомами или болеющие легкими и атипичными формами являются источниками распространения инфекции. Все вышеизложенное свидетельствуе о необходимости качественно нового подхода к решению вопроса ранней лабораторной диагностики коклюша и об актуальности проведенных исследований. Время ответа о наличии возбудителя в материале от больного можно сократить при использовании серологи ческого метЬда, позволяющего идентифицировать его в короткий срок. Для этой цели могут быть применены эритроцитарные антительные диагностикумы способ получения которых состоит в связывании сенситина - коклюшного гамма-глобулина с эритроцитами LI. J- Выявляемая концентрация коклюшных бактерий в 1,0 мл составляет 8-101,6;iO микробных клеток. Однако даже при условииподбора oптимaльнFJIx режимов сенсибшшзации эритроцитов гамма-глобулином или другим сенситином, разрушающая способность эритроцитарных препаратов ограничена прежд всего особенностями самого биологического носителя и характером взаимо действия (физико-химическим) между сенситином и матрицей. Кроме того, большое значение имеет качество самих эритроцитов, зависящее от многих условий, таких, как пол, возраст 4 гормональный статус животного-продуцента, время взятия крови. В связи с этим воспроизводимость результатов может варьироваться. Таким образом, причинами, затрудняющими использование зритроцитарных диагностикумов, являются .недостаточная их активность в серологических реакциях, лабильность эритроцитов к воздействию экстремальных факторов, затруднения при стабилизации и стандартизации эритроцитарных препаратов и т.п. Перспективным направлением является создание иммуноглобулинового диагностикума на синтетической основе. Такой подход позволяет повысить активность и специфичность препарата за счет стереокомплементарности гомологических структур - активных центров антител и антигенных детерминант. Известен способ получения пиагностикумов для серологических реакций . на основе синтетических частиц, который заключается в связывании иммуноглобулина против грамотрицательных бактерий с матрицей - полистиролсульфохлоридом в буферном растворе при рН 7,2-8,5 в течение 3 ч при 20 С и 12 ч при 4°С 121. Диагностикумы используют для серологической идентификации возбудителей особо бпасных инфекций, в том числе и коклюша. Однако получение препаратов по этому способу не обеспечивает достаточной серологической активности при удовлетворительной специфичности препаратов, что снижает чувствительность и усложняет учет реакций. Активность диагностикумов в реакции агломерации изменяется от 10 , до 10 -10 микробных .клеток в 1,0мл, При создании коклюшного иммуноглобулинового диагностикума по указанному способу выявилась-еще одна особенность - препараты приобретают свойство спонтанно склеиваться. IЦелью изобретения является получение диагностикума для серологической идентификации коклюш гых бактерий с повьшенной серологич :ской активностью. Поставленная целт- достигается способом получения диагностикума для серологической иденткжкации коклюшных бактерий путем свя шания иммуноглобулинового сенситиьа с матрицей на основе полистирол в буферном растворе при рН 7,5-7,7 в котором в качестве матрицы предлагается исполь зовать смесь полистиролсульфохлорида и полистирола, обработанного диазометаном, взятых в весовом соотношени 3:1, а в качестве сенситина - смесь равных количеств иммуноглобулинов Ы 3 из коклюшной агглютинирующей сыворотки и процесс вести в присутствии 1-2%-ного бычьего альбумина в течение 13,5-14 ч при повышении температуры от 20 до 34°С.. Введение в матрицу полистирола, обработанного диазометаном, обусловливает цветовой эффект, в результате чего повышается наглядность серологи ческого теста. Выбранное соотношение между компо нентами позволяет более рационально расходовать исходное сырье и обеспе чивает эффективность выявления коклюшных бактерий. При увеличении кислотности буферного раствора наблюдается хлопковани антител, а в резко щелочной среде снижается процент связывания сенсити нов с синтетическим носителем. В течение 13,5-14 ч происходит ма симальное связывание искусственно скомпонованных растворов коклюшньк иммуноглобулинов (на 97-98%)« Увелич ние времени иммобилизации поэтому нерационально. В течение меньшего времени иммобилизации не удается пол чить высокоактивный диагностический препарат. Температурный режим выбран с учетом особенностей используемых сенситинов. При более высокой температуре происходит самоагрегация иммуноглобулинов. Постепенное увеличение температуры при иммобилизации необходимо для наиболее полного связывания иммуноглобулинов М и J. Частицы матрицы в присутствии большого количества белков приобретают способность к само агрегации, в связи с чем возникает необходимость введения с абилизаторов. Полученный продукт обладает высокой сорбционной емкостью. Выявляемая концентрация коклюшных бактерий в исследуемом материале до микробных клеток в 1,0 мл. Пример. 30 мг порошка, состоящего из смеси (3:1 по весу сухого компонента) сульфохлоридполистирола и полистирола, обработан- ного диазометаном и измельченного до размера частиц 1-8 мкм, смешивают в 10 мл 0,15 М фосфатного буфера с 10 мг иммуноглобулинов М и ) в присутствии 0,1 г альбумина и 0,02%ного раствора пиридина. Выделение гамма-глобулинов из коклюшной агглютинирующей сыворотки проводят с помощью метанола С31, разделение иммуноглобулинов - на колонке с сефадексом G-200. Иммуноглобулины М искусственно выделяют из больших количеств агглютинирующей сыворотки и концентрируют в меньшем объеме, после чего антитела классов М и i соединяют в равных пропорциях. рН среды строго выдерживают равным 7,6, экспонируют 14 ч, постепенно повьш1ая температуру от 20 до . Затем трижды по 10 мин отмывают центрифугированием при 3000 об/мин 1,5%-ным раствором аминокислотного экстракта углеводородных дрожжей БВК. Осадок взвешивают в 1,5%-ном растворе того же экстракта и лиофилизируют. Методика постановки реакции. На обезжиренное стекло наносят 0,1 мл исследуемого материала, добав-. ляют 1 каплю диагностикума. Стекло покачивают в течение 1 мин, оставляют на горизонтальной поверхности и через 2-5 мин проводят учет. При положительном результате появляется агломерация частиц диагностикума. В отрицательном случае суспензия остается гомогенной. Испытывают 3 серии диагностикума в 5 повторностях. Диагностикум проверяют в реакции агломерации с ГОМО-, гетерологичными взвесями чистых и смешанных культур (соотношение бактерий с гетерокультурой 1:1, 1:10«, 1:100). Для сравнения используют ритроцитарные диагностикумы, пригоовленные из тех же серий сывороток, РИГА. Специфичность реакций подверяудают торможением. В результате испытаний препараты зарекомендовали себя как высокоактивные, специфичные, сохраняющие свою первоначальную активность в течение 3 лет. Предлагаемый способ обеспечивает выявление минимальных количеств кокюшных бактерий как в чистых, так и в смешанных культурах, что особенно важно при исследовании материала от

$10406546

больных. Новый способ экономически аает своевременную .изоляцию их и превыгоден, поскольку значительно сокра- рывает дальнейшее распространение Цает время исследования. Кроме того, инфекционного начала среди детйкого быстрое выявление боЛьных обеспечи- контингента.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУЙА для серологической идентификации коклюшных бактерий путем связывания иммуноглобулинового сенситина с Матрицей на основе полистирола в буферном растворе при рН 7,5-7,7, отличающийся тем, что, с целью повышения серологической активности диагностикума, в качестве матрицы . используют смесь полистиролсульфохлорида и полистирола, обработанного диазометаном, взяток в весовом соотношении 3:1, а в качестве сенситина смесь равных количеств иммуноглобулинов М и из коклюшной агглютинирующей сыворотки и процесс ведут в присутствии 1-2%-ного бычьего альбумина в течение 13,5-14 ч при повьш1ении температуры от 20 до .