Способ получения диагностикума Советский патент 1983 года по МПК A61K39/02 

1

Изобретение относится к области медицины и может найти применение в лабораторной диагностике коклюша, особенно при индикации бессимптомных или клинически слабо выраженных форм инфекции.

Известен способ получения кок/иошного антигенного диагностикума путем обработки формалинизированных эритроцитов танином с последующей сенсибилизацией их антигеном и фиксацией формальдегидом 1 Я

Однако известный способ недостаточно чувствителен.

Целью изобретения является повьшение чувствительности диагностикума.

Указанная цель достигается тем, что при осуществлении способа формалинизированные эритроциты сенсибилизируют антигеном и фиксируют формальдегидом.

Отличительной особенностью способа является то, что эритроциты до сенсибилизации обрабатывают ультразвуком

при частоте 42-50 кГц и амплитуде 6080 мкм в течение мин, а сенсилилизацию осуществляют при ультразвуковом воздействии в том же режиме в течение 1-3 мин в начальный период контакта эритроцитов с антигеном.

Способ осуществляется следующим образом.

Формалинизированные эритроциты барана отмывают от формальдегида нейт10ральным (рН 7,0-7,2) стандартным солевым раствором, содержащим 0,85% хлорида натрия (NaCi) и 0,5 натрия лимоннокислого трехзамещенного (C,). Полученный эритроци

5 тарный осадок ресуспендируют в стандартном солевом растворе, готовят 5 15 эритроцитарную взвесь и подвергают ее ультразвуковому воздействию (частота 42-50 кГц, амплитуда 602080 мкм, экспозиция 5-15 мин). Обработанные ультразвуком и однократно отмытые стандартным солевым раствором Формалинизированные эритроциты соеди31няют с ультразпуковым антигеном, смес подвергают воздействию ультразвука в течение 1-3 мин. Последующий контакт антигена с эритроцитом осуществляют при температуре в течение 1-2 ч Затем в получаемый препарат добавляю формальдегид (1%), хранение готового препарата осуществляют в присутствии формальдегида. Контрольный препарат готовят анал гичным образом, исключая сенсибилиза цию эритроцитов коклюшным антигеном-. Способ поясняется следующим приме ром. Приме р. Эритроциты барана ко сервируют формальдегидом по методу Чизмеса в модификации М.И. Леви с соавт. (1965). Для получения антигенов используют культуру Bordetella pertussis штамм 3051 выращенную на кузеиновоугольном агаре (среда КУА) при температуре в течение 72 ч. Выращенные микроорганизмы собирают с питательной среды, суспендируют в стерильном 0, растворе хлорида натрия рН 7.0-7,2, доводят густоту микробной извести до 1500 MEM в 1,0 мл по оптическому стандарту Государственного контрольного института медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича. Микробную взвесь дезинтегрируют ультразвуком (частота кГц, амплитуда 60-80 мкм, экспозиция 10-15 мин), антиген отделйют центрифугированием при ISOOO об/мин, в течение 60 мин при . Для получения диагностикума формальнизированные эритроциты отмывают нейтральным стандартным солевым раствором ( д, 2-3 мин), доводят эритроцитарную взвесь до центрации и подвергают ультразвуковому воздействию (частота . кГц, амплитуда 60-80 мкм, экспозиция мин). Затем эритроциты отмывают стандартным солевым раствором, ресуспеидируют и к суспензии эритроцитов добавляют антиген в дозе 5 10 мкг по белку на 1,0 мл эритроцитов и смесь дополнительно подвергают ультразвуковому воздействию в течение 1-3 мин. Экспозиция сенсибилизации составляла 1-2 ч при температуре +37°С, для стабилизации готового препарата добавляют 1 формальдегида. По окончании процесса проводят отмывание эритроцитарного диагностикума от излишков и связанного антигена. Хранение препарата осуществляют в присутствии 1 формальдегида. Активность контрольных препаратов, а также опытных диагностикумов, приготовленных при воздействии на эритроциты таниновой кислоты (по способу прототипа), а также предлагаемым способом при ультразвуковом воздействии сенсибилизируют ультразвуковым кок-люшным антигеном и исследуют в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), параллельно с реакцией торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА). Кроме того, специфичность исследуемых диагностикумов проверяют при постановке РПГА с гетеролсгичной (паракоклкзшной) системой. В табл. 1 представлены опытные данные по изучению активности и специфичности диагностикумов, полученных при действии таниновой кислоты и ультразвука, с целью повышения гемосорбционной активности формалинизированных эритроцитов барана. Таблица 1

Примечание: активностьдиагностикумов представлена в 1 X геом.р 95 обратных величин титров коклюшной и паракоклюшнойагглютинирующей сыворотки.

Анализ полученных результатов свидетельствует о значительном повышении специфической активности диагностик умов , полученных предлагаемым способом по соавнению с прототипом

(0,,05).

Данные РТПГА и перекрестной РПГА с паракоклюшной агглютинирующей сывороткой позволяют отметить --высокую специфичность диагностических препаратов, приготовленных предлагаемым способом, по сравнению с прототипом. Данные эритроцитарные ультразвуковые диагностикумы имели высокие титры в РПГА (до 1:9,6 млн) при постановке реакции с гомологичной (коклюшной)

Химическое Таниновая кислота

Физическое

Ультразвук

||Примечание:

Анализ полученных результатов свидетельствует о возрастании специфической активности диагностикумов (Р 0,05), полученных при дополнительном ультразвуковом воздействии в начальный период контакта антигена с эритроцитами, обработанными ультразвуком.

Таким образом, способ позволяет получить диагиостикум высокой активности и специ1 ичности.

сывороткой, при постанбвке РПГА с гетерологичной (паракоклюшной) сЬвороткой активность диагности..умов бьша в 800-3000 раз ниже 0,,02.

Кроме того, кратковременное применение ультразвука в начальный период сенсибилизации эритроцитов ультразвуковым кокт)шным антигеном позволяет повысить специфическую активность получаемого диагностикума и увеличить эффективность способа в результате более равномерного распределения антигена, улучшения-условия контакта антигена и эритроцитов и возможной активации антигена под действием ультразвука (табл. 2).

Таблица 2.

1,15±0,26 1 ,2П±0,П

3,,28

3,16±0,19 3,21+0,18 3,22+0,19

Формула изобретения

Способ получения диагностикума путем сенсибилизации формалинизированных эритроцитов антигеном и фиксации формальдегидом, отличающийс я тем, что, с целью повышения чувствительности диагностикума, эритроциты до сенсибилизации обрабатывают ультразвуком при частоте 2-50 кГц и активность диагностикумов представлена в 1д X геом. ±.1 р 95 обратных величин титров коклюшной и паракоклюшной агглютинирующей сыворотки.

710019 08

амплитуде 60-80 мкм в течение 5-15 мин Источники информации, а сенсибилизацию осуществляют при принятые во внимание при экспертизе ультразвуковом воздействии в том же .

режиме в течение 1-3 мин в начальный пе-. 1; Каральник В.В. Эритроцитарные риод контакта эритроцитов с антигеном. S диагностикумы. 1976, с. 8.