Способ определения антиокислительной активности вещества Советский патент 1983 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к фармако логии и может быть использовано как в практической фармакологии,так и в научных медицинских и биохимических исследованиях.

Известен способ определения антиокислительной активности веществ путем спектрофотометрического измерения продуктов реакции взаимодействия липидов с субстра-том, включающий приготовление реактивов, поочередное приготовление опытных и контрольных проб, их термостатирование и инкубацию, построение калибровочной кривой ij .

Однако указанный способ не обеспечивает быстроту ос1гществления, а отсутствие химической стойкости ряда реактивов (этанольные растворы перекиси водорода и иодата калия) существенно снижает точность определения антиркислительной активности.

Известен способ определения антиокислительной активности веществ путем исследования хемилюминесценции .модельной системы, включающей митохондрии в изучаемое вещество в присутствии ионов двухвалентного железа 2j . .

Известный способ не является достаточно точным и быстрым по выполнению. Неточность способа обусловлена, с одной стороны, трудностью определения истинного значения угла наклона условной прямой начальной стадии медленной вспышки хемилюминесденции в связи с тем, что зависимость интенсивности хемилюминесцендии от времени не является линейной, а с другой стороны, нестабильностью используемой модели суспензии митЛхондрий, приготовление, которойсвязано с методическими трудностями их выделения . При этом приготовление суспензии митохондрий занимает не . менее 40-50 мин,а регистрация медленной вспышки хемилюминесценции в зависимости от концентрации антиоксидантов осуществляется от 30 до 60 мин.

Цель изобретения - повьяиение точности и ускорение способа измерений антиокислительной активности вещества.

Указанная цель достигается тем, что, согласно способу определения антиокислительной активности вещества путем исследования хемилюминесценции модельной системы,раствор исследуемого вещества вводят в 21,3 мМ этанол-буферный раствор олеиновой кислоты рН 7,5 и добавляют инициатор - ионы двухвалентного железа, после чего регистрируют быструю вспышку хемилюминесценции и по снижению величины ее светосуммы после добавления исследуемого воцества определяют антиокислительную активность вещества.

Способ осуществляют следующим образом.

Готовят модельную систему с конечной концентрацией олеиновой кислоты 21,3 мМ и рН 7,5. Олеиновую кислоту в количестве 319,3 мМ растеоряют в 4 мл этанола и прибавляют 7 мл 20 мМ раствора- . Затем тщательно перемешивают, доводят рНмодельнрй системы до 7,5 .-10 н.раствором КОН.К О,8 мл приготовленной модельной системы добавляют 0,2 мл раствора исследуемого- антиоксиданта (в этаноле или фосфатном буфере) и переносят кювету в. установку для

измерения сверхслабых свечений. В данную кювету быстро вводят 1 мл 2 Юраствора FeSO 7 и регистрируют на самописце или с помощью интенсиметра в течение 3-5 с быстРУ вспьшку хемилюминесценции.Затем проводят контроль аналогично опыту, только вместо раствора анти- оксиданта добавляют 0,2 мл его растворителя. Определяют светосуммубыстрой вспышки, вычисляют процент снижения ее по сравнению с контроле-м и данные заносят в протокол исследования.

Измерение хеми.люминесцеиции проводят с. помощью установок для измерения сверхслабых световых потоков, работающих в режиме счета фотонов .

Расчет, При комнатной температуре в течение 5 с регистрируют быструю вспышку хемилюминесценции при добавлении инициатора - ионов двухвалентного желе.за - в кювету с модельной системой, содержащей исследуемый антиоксидант,, и производят измерение ее интенсивности (число импульсов NQ), затем измеряют интенсивность хеми.шоминесценции в контроле (число импульсов N. ) . Если, например, N(,5000, а N, 7500, то величи-ну антиокислительной активности (АСА) определяют по формуле

--(-..,oo% 33,,.

АОА

Если шумовой фон хемилюмпнесцентной установки относительно высок, то с целью повышения точности измерения АОА веществ проводят учет вклада шумовых импульсов фотоумножителя в измеряемую величину. Если для хемилюминесцентной установки за 5 с зарегистрировано число шумовых импульсов , то АОА вычисляется по формуле

. , No-Ny / 5000-адО

-й ;Г°-Гт15 :) ° Пример . Проведено определение антиокислительнсй активности ряда антиоксидантов. Липидорастворимый антиоксидан - oi -токоферол - растворяют в этаноле перед введением в модельную систему, а водорастворимые антиоксиданты - аскорбиновая

кислота, никотиновая кислота и КАДФ в фосфатном буфере.

Антиокислительная активность некоторых антиоксидантов, определяемая предлагаемым способом,при убывании их концентрации в модельной системе представлена в таблице.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВА путем исследования хемилюминесценции модельной системы, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и ускорения способа, раствор исследуемого вещества вводят в 21,3 ММ этанол-буферный . раствор олеиновой кислоты рН 7,5 и добавляют инициатор - ионы двухвалентного железа, после чего регистрируют быструю вспышку хемилюминесценции и по снижению величины ее светосуммы посде добавления исследуемого вещества определяют антиокислительную активность вещества,i

Ход работы по предлагаемому способу занимает 6-8 мин, что дает выигрыш во времени по сравнению с известными способами в 5-7 раз.

Минимальные концентрации антиокси- о дантов, определяемые предлагаемым способом, составляют в среднем 510 г вещества. Так, для ot-токосферола определяемая по предлагаемому способу концентрация 1,210м, а по способу - прототипу 0,.

Предлагаемый способ позволяет определить антиокислительную активность не только липидораст-воримых но и водорастворимых антиоксидантов, а также обеспечивает высокую чувствительность, хорошую воспроизводимость., быстр и прост в исполнении.