Способ количественного определения замещенных цефалоспоринов Советский патент 1983 года по МПК G01N31/08 

Изобретение относится к аналит ческой химии, а именно к способам определения природных цефалоспорииов и их ядер - 7-аминоцефалоспорановых кислот, и может быть использовано в лабораториях микробиологической и медицинской промышленностя при производстве р-лактамных антибиотиков цефалоспоринового ряда. Цефалоспорин С и 7-аминоцефалоспорановые кислоты представляют собой 3,7-замещенные-л -цефем-4-карбо новые кислоты следующей структурной формулы RfТ4Н-СН-СТ: CHj СО-ll #C-CH2-B; где в случае цефалоспоринов Г В,СО(СНг)зСНг-СООБ:; Tllbt . R rdcOCHg, ОН,Н i а в . случае 7-амино1 ефалоспорановых кислот , R2 oc:ocH , он, н. ; Известен способ определения цефа лоспоринов тонкослойной хроматографйей на пластинах фирмы Antec (Швей цария) с химически связанной фазой ОРТ1 и с последующим элюированием смесью воды с диоксаном, взятых в объемном соотношении 98:2 с последующей обработкой элюата нингидрином и его фотометрированием 1 Недостатком способа является малая чувствительность и невозможность определения 7-аминоцефалоспор новых кислот. Известен способ определения 7-ам ноцефалоспорановых кислот тонкослой ной хроматографией на пластинах Merch siEica GeC F 25л элюированйем 0,5 М водным раствором хлористого натрия с последующим фотометрированием элюата при 254 нм. Однако данный способ характеризу ется невысокой точностью и невозможностью определения цефалоспоринов С. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемым результатам является способ ко личественного определения цефалоспоринов С путем жидкостной хроматографии на анионообменной смоле SAX-ZIPAX фирмы DU pont с частицами размером 25-37 мкм, емкостью ,12 мкг-экв/г с последующим элюиров нйем боратным буферным раствором с рН 9,6 при скорости элюирования 27 мл/ч при комнатной температуре последующим спектрофотометрированием элюата при 254 нм 2. Недостатком способа является малая чувствительность (), невысокая точность (близкие времена удерживания цефалоспорина С и дезацетилцефалоспорина С) и невозможность определения 7-аминоцефалоспора« новых КТ1СЛОТ, т.е. ограниченная область применения Цель изобретения повышение точности, чувствительности способа и расширение области его применения. й,елъ достигается тем, что согласно способу количественного определения замещенных цефалоспоринов путем хроматографирования анализируемого вещества на анионообменной смоле, элюирования с использованием буферного раствора с последующим фотомётрированием элюата в качестве анионообменной смолы используют смолу с размером частиц 5-25 мкм, емкостью 3-5 мг-экв/л, в качестве элюента используют фосфатный или ацетатный буферный.раствор с рН 5-8, содержащий 5-2р об.% этанола, и элюирование ведут со скоростью 10-40 мл/ч.. При работе со смолой, диаметр частиц которой меньше 5 мкм, для Достижения рабочей скорости элюации (10 мл/ч и более) требуется значительное увеличение давления в колонн€j что приводит к быстрой потере проницаемости колонки и сокращает срок ее эксплуатации. Уменьшение .же скорости элюации нежелательно, поскольку увеличивается продолжительность анализа (до 5 ч и более). Использование в качестве стационарной фазы частиц диаметром более 25 мкм значительно ухудшает качество разделения. Применение анионообменной смолы с емкостью меньшей чем 3 мг-экв/г затрудняет анализ многокомпонентных систем, вызывает необходимость разбавлять анализируемые пробы, что сказывается на точности определения. Если емкость смолы более 5 мг-экв/г, то наблюдается сильная сорбция компонентов на носителе. Это. в свою очередь требует элюента более концентрированного, чем 0,5 М. При использовании в качестве элю1 ента растворов с концентрацией соли менее 0,1 М про.исходит увеличение времени.удерживания соединений на колонке, что удлиняет процесс разделения до. б ч и более... Использование концентрации выше 0,5 М невозможно из-за выпадения в осадок кристаллов соли в присутствии этйнола. Применение злюентов с рН меньше 5 нежелательно вследствие уменьшения сорбции компонентов анализируемой смеси. Проведение элюации при рН больше 8 осложняет процесс анализа уэ-за частичной деструкции опредёля емых веществ, Увеличение содержания этанола выше 20% делает невозможным разделе ние цефалоспорина С и 7-амино-З-дезацетилцефалоспорановой кислоты, а также приводит к набуханию частиц сорбента и потере проницаемостикр лонки. Если концентрация этанола ниже 5%, то отсутствует элюация компонентов сорбента. Проведение разделения, при малых, (менее 10 мл/ч) скоростях элюации увеличивает продолжительность анализа и приводит к размыканию зон сорбции, что понижает чувствителькость и точность метода. Элюирова ние при скоростях потока более 40 мл/ч ухудшает разрешение соедине ний, имеющих небольшое различие вре мен удержания, а также приводитк спрессованию частиц анионообменной смолы и делает колонку непроницаемой. Компоненты смеси (дезацеток цефалоспорин С, дезацетилцефалоспорин С, цефалоспорин С, 7-амино-Здезацетоксицефалоспорановую кислоту 7-амино-З-дезацетилцефалоспорановую кислоту и 7-аминоцефалоспорановую кислоту) детектируют по их поглощению при длине волны 254 нм. Идентификацию индивидуальных компонентов смеси производят путем сравнения величин времени их удерживания на ко |лонке с соответствующей характеристикой стандартных образцов. Количе ство (или концентрации) соединен НИИ в анализируемой смеси определяю путем построения соответствующих ка либровочных кривых. Для построения калибровочных кри вых аликвоты стандартных растворов индивидуальных веществ хроматографи руют и определяют площади пиков на хроматограмме по формуле S н 1, где S - площадь пика; Н - высота пика;. j W 2 - ширина пика на половине высоты. Величину калибровочного коэффйци ента в области линейности кгшиброво ной кривой определяют по формуле S к - , где К - калибровочный коэффициент; с - концентрация компонент в М (или мг/мл). П ри м е р 1.5 мкл раствора содержащего смесь цефалоспорика С (ЦПС), дезацетилцефалоспорина С (ДАЦПС)., дезацетоксицефгшоспорина С (ДОЦПС), 7-аминоцефалоспорановой кислоты (7-АЦК), 7-амино-З-дезацети цефалоспорановой кислоты (7-АДАЦК) 7-амино-3-дезацетоксицефалоспоранов кислоты (7-АДЦК) наносят на колонку 250x2,2 мм жидкостного хроматографа фирмы Varian термостатированную при , с анионообменной смолой марки Hetache-2632 (Япония), имеющей емкость 3,2 мг-экв/г и размеры частиц 13,5±1,5 мкм, в форме и разделение осуществляют 0,25 М раствором H HoPOjj, рН 7,0, содержащим 10% этанола. Скорость потока 20 мл/ч. Детектирование осуществляют в проточной кювете с объемом 8 мкл при длине волны 254 нм. Время удерживания, приготовленные по навеске концентрации и определенные из хроматограмм концентрации (М) компонентов в смеси сведены в табл.1-6. Ошибка измерения ±2%. Точность определения 98%. Пример 2. 5 мкл раствора, содержащего смесь ЦПС, ДАЦПС, ДОЦПС, 7-АЦК, 7-АДАЦК и 7-АДЦК наносят на термостатированную при 50с колонку 250X2,2 мм с анионообменной смолой марки Aminlmex А-27 Duopam (США) емкостью 3,2 мг-экв/г и размерами частиц 5±1 мкм, и разделение проводят 0,25 М раствором )2 Р 8,0, содержащим 10% этанола при скорости потока 40 мл/ч. Точность определения 98%. Ошибка изм ерения ±2%. Пример 3.5 мкл раствора, содержащего смесь шести компонентов, наносят на колонку с анионообменной смолой марки ДА-Х8 (США) емкоетью мг-экв/г и размерами частиц 25i2 мкм. Разделение проводят в ус:ловиях, описанных в примере 1, за исключением того, что в качестве подвижной фазы используется CHiCOONH рН 5,0. . . Ошибка измерения 14%. Точность определения 96%. П р и м е . 5 мкл культуральной жидкости Chephaeosporium acremonium с неизвестным содержанием цефалоспорина, предварительно отфильтрованной от питательной среды и клеток, наносят на колонку с анионообменной смолой марки DOUX 1x8 (ФРГ) с размерами частиц 13,5±1,5 мкм и емкостью 5 мг-экв/г. Разделение проводят в условиях, описанных в примере 1. П р и м е р 5. Образец в объеме . 5 мкл, приготовленный, как указано в примере 4, наносят на колонку с анионообменной смолой емкостью 3,2 мг-экв/г с размерами частиц 13,5±1,5 мкм, и разделение проводят раствором 0,1 М Р 7,0, содержащим 50% этанола, в условиях, описанных в примере 1. Примерб. Образец в объеме 5 мкл, приготовленный как указано в примере 4, наносят на колонку с

51048401

анионообменной смолой емкостью содержащих ядра цефалоспоринов в

3,2 мг-экв/г с размерами частиц многокомпонентных и реальных объек13,5±1,5 мкм, и - разделение провидят, .тах (на 3 вещества больше, чем по

раствором 0,5 М , рН 7,0,прототипу). Точность определения,

содержащим 20% этанола,,в условиях,96-981 чувствительность определеописанных в примере 1. ния 10 М, т.е на порядок вьпае,

Таким образом, предлагаёкыйспо-жительность анализа составляет бсоб позволяет определить б веядеств,25 мин.

.. I Т а б л и :Ц а 1

Компоненты ДАЦПС ДОЦПС I ЦПС 7-АДАЦК 7-АДЦК 7-АЦК

Время удержания,.

мен6 8,5 10,5 12 15,5 24,5

чем по прототипу. При этом продол

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗАМЕЩЕННЫХ ЦЕФАЛОСПОРИНОВ путем хроматографирования анализируемого вещества на анионообменной смоле, элюирования с использованием буферного раствора с последующим фотометрированием элюата, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности, точности способа и расширения области его применения, в качестве анионообменной смолы используют смо.лу с ра змером части-ц 5-25 мкм, емкостью 3-5 мг-экв/г в качестве элюемта используют фосфатный или ацетатный буферной раствор с рН 5-8, содержа- щий 5-20.О6.% этанола, и элюирова- g ние ведут со скоростью 10-40 мл/ч. (Л 4i 00 4

Концентрация по - ,. навеске, М 3-10 2. 2-Ю

Концентрация рп- «,е- с

-ределенндя, М 3,0б10 2-10- 2,03:1(Г4 ,92-10 1,97-10 4 ,9-1Г

.. - ..: :. г т а б л и ц а 2

. Компоненты- ЛАЦПС ДОЦПСЦПС7-1ШАЦК7-АДЦК 7-АЦК

Время удерживания -

мин . 34,36 б,б.-8,8 14,5 Концентрация навеске, моль/л 1ОГ 5-Ю- 8-Ю .... а ...... Концентрация определенная . . ,. моль/л 0, 4,9-10 Компоненты ДАЦПС ДОЦПС Время удержива- ния, мин3 4,1 Кодёнтрация по . навеске, М 81Г 1«10- Крндентргщия .. определенная;,М 1,04-1 СГ . . . . - - .. . . Т,, В,861(Г 2,071СГ . .- -.-. . .. - .. 5-10- 2-Ю- , 2 1р-5 4 10- 5-10- . . .. . -- - с к 8,,96ЧСГ 4,1lO 5,110 f; Т а б л .и ц а 3 ЦПС 7-АДАЦК I 7-АЦК ... 4,9 б 7,2 10,5 1ЧО- б-Ю