Способ выделения и очистки кислой протеиназы из растворов Советский патент 1976 года по МПК C12D13/10 

Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической промышленности, а именно к способам выделения и очистки кислой протеиназы из растворов.

Известен способ выделения и очистки кислой протеиназы из растворов, например кулътуральной жидкости граба Aspergri Eos awciTnopi , предусматривающий сорбцию фермента на ионообменном сорбенте с последующей десорбцией его элюентом 1 При работе по изьесткому способу имеют место большие потери ферм:ента на стадиях очистки (до 90%), Получаемый фермент обладает недостаточной активностью, причем из-за больших потерь фермента на стадиях очистки работа связана с увеличением объема исходного материала и большого расхода органического растворителя, что повышает себестоимость фермента.

Для ликвидации этих недостат-ков согласно преднагаемо1у1у способу в качестве сорбента испопьзуют анионообменный (отечествв ный)гель - сорбент в СС форме, синтезированный на основе поливинилового спирта,имеющий форму;1у

-vH.jT CK-CR5 CH-CH2-CH

и обладающий сорбционной емкостью 0,5О,8 мг.экв/г, набухаемостью не менее 2О25 мг/г, при этом процесс сорбции осуществляют при рН 4,0 - 5,0, а процесс десорбции проводят 10%-ным раствором поваренной соли при рН 7,0-8,0.

Для перевода анионообменной смолы (АГС1п) в С1 -форму ее подвергают набуханию в воде, затем отфильтровывают и обрабатывают ЗО-бО мин 5%-ным раствором соляно кислоты в количестве 3-5 об. на 1 об, набухшей смолы. После фильтрации смолу отмывают дистиллированной водой до рН 6,О7,0, Расход воды при этом составляет 1О15 об. на 1 об. смолы.

i

Использование смолы АГС-1п в С1-форме с ионообменной емкостью 0,5-0,8 мг. экв/г и набухаемостью 2 О-25 мл/г обеспечивает 90-94% сорбции кислой протеиназы и 86-90% десорбции фермента, Злюент берут в количестве 8-10% к объему обрабатываемой исходной культуральной жидкости,

В результате такой обработки достигается десятикратное концентрирование кислой протеиназы и в 5 раз повыщается степень очистки фермента. Из элюента фермент выделяют одним из известных способов, например осаждением органическими растворителями,

Препарат кислой протеиназы, полученный по предлагаемому способу, имеет активность определенную стандартным методом (модифицированный метод Ансона с казеинатом натрия) ПА 200-250 ед/г по активности он в 1ООО-150О раз выше, чем активность его в исходной культуральной жидкости.

Пример 1, Концентрирование и эчистку кислой протеиназы проводили из фильтрата культуральной жидкости Asp- awarnofi 78-2, Процесс сорбции вели в динамических условиях в колонке высотой 30 см и диаметром 3,5 см, Анионообменный гельсорбент АГС-1п в количестве 5 г замачивали и отмьтали дистиллированной водой после чего ионообменник переносили в колонку. Подготовленный таким образом ионообменник занимал 2/3 объема колонки. Обработку проводили 5%-ным раствором НС1, для чего через колонку пропускали 600 70О мл этого раствора с последующей отмывкой 1,5 - 2,0 л дистиллированной воды.Затем через колонку пропускали фильтрат культуральной жидкости с активностью 0,15 ед/мл и рН 4,6. Процесс сорбции вели со скороетью 500 мл/час до появления в фильтрате фермента 5-10% протеолитической активности от исходной (в расчете на 1 мл). Через колонку &1ЛО пропущено 830 мл фильтрата культуральной жидкости,

Сорбционная емкость смолы АГС-1п по кислой протеиназе составила 25 ед/г смолы В этих условиях на смоле было сорбировано 94% фермента от содержавшегося в фильтрате культуральной жидкости.

Десорбцию фермента проводили 1О%-ным раствором NaCl с рН 7,5. Расход элю- ента составил 85 мл, скорость его 15012О мл/час. Десорбция прощла на 90%, уделная активность фермента в элюате в 5 раз выше, чем активность в фильтрате культуральной жидкости. Из полученного элюата после предварительной корректировки рН до 4,5 - 5,0 фермент осаждали этанолом в соотношении элюата и этанола 1:4, Осадок отделяли на центрифуге и высушивали лиофильно,

П р и м е р 2. Концентрирование и очиску кислой протеиназы проводили из фильтрата культуральной жидкости гриба Aip-qwa-mo 16, Процесс сорбции вели в динамических условиях в колонке высотой 150 см и диаметром 16 см. В колонку загружали 250 г (анионообменного гель-сорбента АГО1п) по сухому весу после предварительной его обработки и перевода в С1 -форму. Через колонку со скоростью 10 л/час пропускали 8О л фильтрата культуральной жидкости Asp- otwaTnopi 16 с активностью кислой протеиразы 0,2 ед/мл и рН 4,15. Сорбция фермента в этих условиях прошла на 94%.

Десорбцию кислой лротеиназы проводили

10%-ным раствором NaC при рН 7,0. Элюат в количестве 8 л пропускали через

колонку со скоростью 1,2-1,5 л/час. Десорбция фермента прошла на 86%. Активност фермента в элюате в 8,5 раз выше чем активность фильтрата культуральной жидкости. Удельная активность фермента была повышена в 5-7 раз. Фермент из элюата с рН 4,5 осаждали этанолом, осадок отделяли центрифугированием и высушивали лиофильно. Высокоочищенный препарат кислой протеиназы Протаваморрин Г25Х, полученный по предлагаемому способу, имел активность до 230 ед/г. Содержание белка в препарате 45-50%.

Таким образом, применение смолы АГС-1п по предлагаемому способу позволяет одновременно концентрировать и очищать кислую протеиназу непосредственно из фипьтрата культуральной жидкости. Достигнутая десятикратная степень концентрирования фермента в 10 раз сокращает расход органических растворителей, применяемых для выделения фермента, и значительно сокращает емкостное оборудование, используемое для его производства. При этом в 5 раз повышается степень чистоты получаемого препарата. Формула изобретения Способ выделения и очистки кислой протеинааы из растворов,например культуральной жидкости гриба Asperg-Ltfus aivcLmori ,прв дусматривающий сорбцию фермента на ионообменном сорбенте с последующей десорбци- СН.,- СК- СНо- СН-СНп- СИ 1 он о о 1I/X СН CjH4l(C2H5VHC и обладающий сорбционной емкостью 0,50,8 мг.экв/г и набухаемостью не менее 2Q25 мл/г, при этом процесс сорбции осуществляют при рН 4-5, а процесс десорбции при рН 7-8. ей его элюентом, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и активности фермента, снижения его себестоимости, в качестве сорбента используют анионообменный гель-сорбент в Cl -форме, синтезированный на основе поливинилового спирта, имеющий формулу СНоlI сн-он СН2,СН.2 0он о 1I1 -СНо-СН-Ш -СН-СНо-СНИсточники информации, принятые во внимание при экспертизе: 1. Авторское свидетельство Nb 249329, кл,С12 В 13/1О, 1969 г.