Способ получения производных 7-амино3-цефем-4-карбоновой кислоты Советский патент 1978 года по МПК C07D501/04 A61K31/545 A61K31/546 C07D501/22 C07D501/52 

При использовании ВруТКЯ АКрООрГаЩЗмов 7-АДШ не вьшэпягсг ..;; реакхион ной смеси, поскольку глубина гидролиза составляет только 40-60%, Однако в таком способе гидролитичес кая активность используемых ферментных препаратов низкая, поэтому цлитель ность гидролиза даже для малых концентраций субстрата очень велика (8О ч). Применение для получения 7-A.O,IJK малых концентраций субстрата, обусловЛенное с одной стороны низкой активностью используемого катализатора, а с другой стороны малой растворимостью 7-ФАДЦК (или 7-ФМДЦК) в водных растворах с рН 7-85 приводит к сложному методу выделения целевого продукта с использованием органических растворите лей (необходимость регенерации растворителей). Использование органических растворителей для вы целения 7-АДЦК не сколько увеличивает выход 7-АДЦК, вследствие ее меньшей растворимости в водно-органической среде, по сравнению с водной, однако при этом качество выделяемого продукта невысокое (93%-ная чистота). С целью упрощения процесса предлагается способ получения производных 7 амино-3-цефем-4 карбоновой Ю1слоты об щей формулы S HaK-p Y (} где X -водород или отрицательный заряд если I. -пиридиний1 руппа; R. - водород, ацетокси- или пиридинийгруппа, путем деадилнрования7 ациламиноцефал( спорановых производных общей формулы ITTl ,. в,сжош (Н) где RJ , X имеют указанные значения; RI - фенил, фенокси- или тиеншр группа, R,- водород или аминогруппа, р водном растворе при 25-4О°С или их солей с неорганическим или органическим основанием и деадилирование проводят выделенной из микроорганизмаE.coFi пениоиллинацилазой с удельной активностью 4,5-12 ед,,/мг белка, ковалентно связанной с нерастворимым в воде носи телем, полученным на основе сополимера циметакрилата тетраэтиленгликоля и анГИ(фида малеиновой или итаконовой или дитраконовой кислоты, циметакрилата тетраэтиленгликоля, метакриловой кислоты и ангидрида малеиновой кислоты, циметкрилатаокиси полипропилена, акриловой к-цслоты и/или ангидрида малеиновой кислоты, диметакрилата этиленгликоля5 ангидрица итаконовой кислоты и акриловой кислоты или ангидрида малеиновой кислоты, метакриловой кислоты и триметакрилата сополимера окиси этилена и окиси пропилена (la). Предлагаемый способ имеет то преимущество, что благодаря ковалентной свя; :-1 пенйциллинацмлазу можно неоднократ1.-ID использовать без потери активности Крог-ле rorOj можно использовать 10%«ные растворы цефалоспоринов вместо 1%-ных растворов в известном способе, Для провецения способа могут быть использованы практически все ферментные смолы (ФС), в которых пенициллинацилаза ковалентно связана с нерастворимым в воде полимеризатом-носителем. В качестве ФС берут такие, в которых пени циллинацилаза при помощи бромциана ко- валентно связана с полисахаридами, например декстран или сшитые агарозы. Могут быть использовйны также ФС, для получения которых пенициллинацилазу подвергают взаимодействию с бромацетилцеллюлозой или с субстанцией ионообменника на основе замещенного карбоксилгруппами трехмерно сшитого декстрана в присутствии способного к образованию амида соединения, например карбодиимида, причем могут быть использованы и активированные смолы ионообменника, как хлораэгидрид кислоты, смолы акриловой кислоты и сшитые с гидразином смолы из этилена и ангидрида малеиновой кислоты. Особенно пригодной является ФС, в которой пенициллинацилаза ковалентно связана сополимером из акриламида, N,N метиленбисакриламида и малеиновой кислоты, ФС может быть получена следующим образом. Исходный сополимер получают известными методами. После сополимеризации гелеобразную смолу продавливают через сито с отверстиями 0,5 мм, хорошо промывают и высушивают в вакууме, Полимеризованную дикарбоновую кислоту, нагревая в течение 2 ч до 18ос, переводят в ангидрид дикарбоновой кислотьь На 1 г фермента берут Юг сополимера. Из этой смесил.3-4 г прибавляют в раствор фермента в 25О мл 0,05 М фосфатного буфера при рН 5,5;, интенсивно размешивают и через 2 ч добавляют малень56кими дозами остальной сополимер. рН в течение всей реакции поддерживают постоянным, добавляя разбавленный раствор едкого натра. Если через 5 ч отстоявшийся верхний водный cnnf содержит ещё непрореагировавший фермент, цобавляют еше сополимер. Соотношение 1 ч. фермента к 15-2О ч. сополимера является обычно достаточным для полной реакции. После сочетания отфильтровывают связанную с носителем . пенициллинадилазу и интенсивно.промывают водой и 1М раствором поваренной соли. Особенно предпочтительными в качестве используемых ФС являются такие, при которых пенициллинацилаза связана с сшитыми сополимерами, содержашими сополимерные единицы следующего состава: А. О,1-5О, предпочтительно 2-2О, вес. -моноолефиновых ненасыщенных ангидридов дикарбоновой кислоты с 4-9, предпочтительно 4 или 5, атомами углерода, например ангидрид малеиновой. кислоты, итаконовой кислоты и/или цитраконовой кислоты, особенно ангидрид малеиновой кислоты, и Б. 99,9-5О, предпочтительно 8О-98 вес. % ди- и/или поли-{мет)-акрилатов диолов и/или многоатомных спиртов, как диакрилаты или диметакрилаты диолов с 2-4 атомами углерода и/или продукты реакции 1 моль этого диола с 1-2Омоль окиси алкилена с 2-4 атомами углерода или триметилолпропантриметакрилат, особенно диметакрилаты этиленгликоля, диэти.пенгликоля, триэтиленгликоля, тетра-; этиленгликоля или высших полиалкилен гликолей с молярным весом до 1ООО или их смеси Полимеризацию гфоаоцят методом осадительной или бисерной полимеризации в растворителях или смесях растворителей, крторые являются инертными против ангидридных групп, например бензол, при 20-2ОО С, например при 6О-70°С, в присутствии образующих радикалы соединений, например динитрил азоизомасляной кислоты. Полученные таким образом сополимеры для получения ФС при рН 5,7-6,8 и 4-ЗО С вводят в водный раствор пенициллинацилазы (1 вес. ч., пенициллинацилазы на 1-1О вес. ч. полимерного носителя). Через 2 ч отсасы вают или центрифугируют и остаток про- мывают соляными растворами высокой ионной силы, например 1 моль водного раствора хлорида натрия. Особенно предпочтительными ФС являются такие, в ко торых пенициллинацилаза связана с сши8тыми- сополимерами, содержащими сополимерные единицы следующего состава: Указанный состав А,, Б. 35-9О, предпочтительно 5О-85, вес. % ди- и/или поли-(мет)-акрилатов диолов и/или многоатомных спиртов, как диакрилаты или диметилакрилаты диолов с 2-4 атомами углерода и/или продукты реакции 1 моль этих циолов с 1-10 молями окиси алкилена с 2-4 атомами углерода или триметилолпропантриметакри-+ лат, например диметилакрилаты этиленгликоля, диэтиленгликоля; триэтиленгликоля, тетраэтиленгликоля5 или высших полиалкилгликолей с молярным весом до 500 или смеси их. В. 5-бО, предпочтительно 1О-5О, вес.% по меньшей мере одного неназванного в п. Б гидрофильного мономера, предпочтительно ненасыщенные гидрофильные мономеры, содержащие по меньшей мере карбоксильную-, аминокарбоиильную-, сульфо- или сульфамоильную группу, причем аминогруппы аминокарбоиильного или сульфамоильного радикалов в случае необходимости могут быть за( С. - С -алкилами или -алкоксиметилом, например акриловая кислота, мет акриловая кислота, полиэ ир малеило вой кислоты, N -виниллактамы, кик М винилпирролидон, метМкриламид, Н -замещенные (мет)акриламнды, как W -метил- и W -метоксиметил-(мет)- акриламид и W -акролоилдиметилтаурин. Сумма компонентов А -В составляет 1OQ вес. То. Сшитые сополимеризаты имеют насыпной объем 2-2О мл/г и .у удельные поверхности 1-4ОО Nr/г и после омыления а11гидридных трупп содержат 0,О2-11 мэкв, кислоты на 1 г„ Полимеризацию проводят методом осадительной или бисерной полимеризации в растворителях или смесях растворителей, которые являются инертными против анидридных групп, например бензоле, при 20-2ОО°С, предпочтительно 5О и 1ОО°С, например 60-70 С, в присутствии обраующих радикалы соединений, например инитрила азоизомасляной кислоты. Для олучения ФС полимернзат вводят в водый раствор пенициллинацилаЬы (предпочи те;шн о 1 вес, Чо пенициллинацилазы а 4-1О вес, ч. смолы) при О-ЗО С, апример 4 -2О С, причем рН путем доавления основания, например натрового елока, поддерживают 5,7-6,8, По оконании реакции отсасывают и промывают уферным или соляным раствором, наприер 1 М раствором хлорида натрия. Особенно лреш10чтйге.1. ;; йЛ;:егся использование ФС, в которо Я9ниц {ллин ацилаэа ковалентно связана с сополиме ром из цимегилакрилата тетраэтиле:нгликоля, ангидрида малеиновой кислоты и в случае необходимости метакриловой КИСЛОТЫо в качестве растворителя берут воцу или смесь вооы и органического растворителя в количестве до 10%, например метаноя, этанол, ацетон или-диметилформ амид. Реакцию проводят при 20-45 С, предпочтительно 35-4О С. Соединение Л растворяют в указанном растворителе, причем раствор должен содержать 2-4О, лучше 4-6, вес, ч, соединения формулы И. Его можно в любом виде приводить в контакт с ФС. ФС может быть, например, суспендирована в растворео При нейтрализации отщепляемого при реакции ацильного раоикала рН поааерживают 6-9, лучше 7,5-8,5, добавляя к реакционной смеси пригодное основание, в качестве которого используют неорганические и органические основания, например трет-фосфат натрия, гиароокиси щелочного металла, карбонаты или гицрокарбонаты щелочного металла, первичные, вторичные и третичны алифатические т ароматические амины, а также гетероциклические основания. Скорость реакции зависит от отношения количества имеющейся связанной с носителем шенициллинацилазы к количеству взятого соединения формулы 11 и от специфической активности используемой связанной с носителем пенициллинацилазы, которая указана в ед./г влажного веса. 1 ед. определена как активность пенидиллинацилазы, которая в течение 1 мин гидрслизует 1 макромоль, пеницил лина Q при 37 С и рН 7,8 в 6-аминопенициллановую кислоту и фенилуксусную кислрту. Для расщепления 1 кг 7-:Фенил ацетамидодезацетоксицефалоспорановой кислоты в течение 2 ч требуются 7OGOO ед. связанной с носителем пенициллинацилазы, соответственно 1 кг мокрой ФС, При концентрации 6% реакционный объем составляет 16,6 л. При более продолжительном времени расщепления требуется соответственно меньще связанной с носителем пенициллинацилазы. По окончании реакции расщепления связанную с носителем пенициллинацилазу отделяют, например, путем фильтрации или- центрифугир.ования и она может быть сразу же исгпэльзовйна для дальнейшей исходной смеси расшенления. Из прозрачного раствора выделяют соедине ше формулы 1 известными способами, например неорганическими минеральнь ми кислотами, как соляная, серная, фосфорная кислоты, или органическими карбоновыми кислотами, как уксусная кислота, у изоэлектрической точки или же методом хроматографии. Выделенный иди полученный хроматографией продукт цля полного удаления отщепляемого раяикала промывают пригодным растворителем, например бутйлшдетатом или ацетоi-.o-..;j И сушат в вакууме,. ; р И м 8 р 1, Расщ&пле-аке соединений формулы я. 2 мм ОЛЬ соединения формулы 11 растЕюряют в 20 мл воды (в случае необхоинмости путем добавления едкого натра) я при рН 7,5 к размешанному раствору в нагретом до 37 С сосудеприбавляют 5 г (влажный вес) ФС (полученной по методу А), поддерживая рН 7,5 10 М едким натром. По окончании реакции связанную с нocитeлe пенициллинацилазу отсасывают через слой спекшихся частиц стекла и промывают водой. Фильтрат и промывную воду сгущают в вакууме при ЗО С до объема 5 мл цефалоспорановую кислоту осаждают, добавляя 5 н. соляную кислот до изоэлектрической точки 3,7, выдерживают 2-3 ч в холодильнике, отфильтровывают, про;чывают 1О мл воды и ацетона и сушат в вакууме. Содержание продуктов находят фотометрическим методом определения освобожденной 7-аминогруппы после реакции с п-оиметилеминобензальдегидом в измененном виде метода Свотека. Экстинкцию при 415 нм сравнивают со стандартными кривыми для чистой 7-АЦК и 7 АД1ДКр Кроме того, идентичность продуктов доказана ИК- и ЯМРслектрометрией и хроматографии на бумаге в системе бутанол-ледяная уксусная кислота-вода (12:3:5). АО В качестве исходного соединения берут 9О8 мг 7(2-тиенил)-ацетамидоцефалоспорановой кислоты (натриевая соль). Продолжительность реакции 42 мин. Получают 7-АЦК, выход 52О мг (88%), чистота 98%, Т 0,27 (не обнаружено аезацетил-7-аминоцефалоспорановой кислоты сТ 0,1О). Бс В качестве исходного соединения берут 866 мг 7-(2-тиенил)-ацетамидо--пиридинийметил--3-цефем-4-карбоксиата. Продолжительность реакции 35 мин. Получают 7-амино-З-пиридинийметил-З цефем-4-карбоксилат, 0,05. Из-за наличия пиридинового кольца в молекуле целевой продукт нельзя выделить у изоэлектрической точки. Полно та разложения и идентичность продукта доказана хроматографией на бумаге. В. В качестве исходного соединения берут 687 мг Т-ФАДИК. Продолжитель ность реакции 27 мин. Получают 7-АДЦ выход 35О мг (84%), чистота 99%, т. пл. 238-240°С (разл,). Г. В качестве исходного соединения берут 696 мг 7-феноксиацетамидодеэацетоксицефалоспорановой кислоть, получают Т-АД ЦК, выход 35О мг (82%), чистота 96%, т, пл. 238-240 0 (разл, Д. В качестве исходного соединения берут 696 мг (л -аминофенилацетил}аезацетоксиаефалоспорановой кислоты, получают 7-АД:ЦК, выход 364 мг (85% чистота 98%. Пример 2. 1кг 7-ФАДЦК растворяют в 12,5 л воды и в течение 2 ч полностью расщепляют при 38 С, добавляя 1 кг связанной с носителем пеницил линацилазы (по методу А) и поддержива рН 7,5 путем непрерывного добавления триэтиламйна. По окончании реакции свя занный с носителем фермент отфильтровы вают и промывают 2 л воды. Фильтрат и промывную воду сгущают в вакууме до объема 3 л при 30-40 С, добавляют 2 л бутилацетата и 5 н. соляной кислотой при рН 3,7+0,1 осаждают 7-АДЦК. Через 2 ч кристаллй отсасывают, промывают 1 л воды и ацетона и сушат в вакуум е при 40 С. Выход 574 г (89%) чистота 98%. Таким образом используют одну и ту же связант/ю с носителем пенициллинацилаау 25 раз. Выход из 25 расщеплений 9О,3%. Примерз. 2г(6 ммоль) 7ФАДЦК суспендируют в 190 мл воды, растворяют, добавляя 1 н. раствор едкого калия до рН 7,8, нагревают до 37 и добавляют 3,2 г ФС, полученной по ме тоду А, поддерживая рН 7,8+0,3 триэтил амином. . Через 1,5 ч реакция заканчивается, ФС отфильтровывают, промывают водой и фильтрат сгушают в вакууме при 50 С до четверти объема. Псх:-,. ле добавления 16О мл метилизобутилкетона разбавленной соляной кислотой устанавливают рН 4,3 и выкристаллизовавшийся осадок выдерживают 1 ч, отсасывают и промывают небольшим количеством смеси вода-метилизобутилкетон. Получают 7-АДЦК, выход 1,01 г (78,8%), т. пл. 238-24О°С (разл.). П .р и м е р 4. 5ОО г 7-ФАДЦК растворяют в 8,3 л воды и полностью расщепляют при 38 С, добавляя в течение 4 ч 22О г связаюшй с носителем пенициллинаиилазы (по методу Б), далее обрабатывают аналогично примеру 2, получая 7-АДДК. Выход 294 г (91%), чистота 97%. Аналогично провоцят 25 расщеплений с такой же связанной с носителем пенияиллинацилазой. Средний выход из 25 расщеплений 90,5%. Примера, 500 г 7- растворяют в 8,3 л воды и при 38 С полностью расщепляют, добавляя 1,1 г связанной с носителем пенициллинацилазы (по методу В). По окончании поглощения триэтиламйна перерабатывают аналогично примеру 2. Получают 7-АДЦК, выход 265 г (86%), чистота 98%. Метод А. Получение ФС. 8О г диметакрилата тетраэтиленгликоля, 2О г ангидрида малеиновой кислоты и 1 г нитрила азоизомасляной 1сислоты растворяют в 1 л бензола и, размешивая, нагревают 4 ч до 60 С. Затем добавляют 1 г гштрила азоизомасляной кислоты и 20О мл петролейного эфира (т. кип. 10О-14О С) и полимеризуют 5ч при 7О С: Порощкообразный продукт отсасывают, взмучивают один раз в бензоле, три раза впетролейном эфире (т. кип. ЗО-5О С) и сушат в вакууме. Выход 94г, насьшной объем 3,5 мл/г, объем набухания в воде 4,7 мл/г, удельная поверхность 5 м /г, содержание кислоты после омыления ангидридных групп 3,5 л экв/г. 1ОО г полученной смолы-носителя суспендируют в 3,5 л водного раствора 48ООО ед. пенициллинацилазы специфическая активность 12 ео/мг протеина (тест с биуретом), поддерживая рН 6,3 1 н, едким натром, суспензию размешивают 2О ч при 25 С, затем отсасывают через большую перегородку спекшихся частиц стекла и промывают 5 л О,О5 М фосфатного буфера при рН 7,5, содержащего 1 М хлорид натрия, и затем тем же буером без хлорида натрия. .Получают5ООг лажной ФС с специфической активностью 58 ец/г, что составляет 290Ор Д, связанной с носителем пенициллинцилааы или 6О%. Получение пенициллинацилазы. Сырой экстракт, содержащий пеницилинацилазу, получают, выращивая Е. соВ о известному способу. Культуру центриугируют, концентрируют в густую суспению и известными- механическими спосоами открывают клетки, в случае необхо