Способ получения иммобилизованного трипсина Советский патент 1983 года по МПК C12N9/76 C12N11/06 

СП

ел ч|

Изобретение относится к медицинс кой энзимологии, а конкретнее к про теолитнческим ферментам медицинског назначения, и может быть использова но при лечении гнойно-воспалительны процессов, например в отоларингологии, стоматологии, при лечении ожогов, гнойных ран и т.д. Известны способы иммобилизации и стабилизации протеаз, в частности трипсина, включающие их связывание с различными носителями, что позволяет повысить их устойчивость к дей ствию температуры, рН, денатирую.щих агентов, к действию ферментов микро организмов, ингибиторов, к автолизу и т.д. Л . Медицинское П1эимерение иммобилизованных ферментов выдвигает специфические требования к свойствам материалов, используемых в качеству носителей ферментов, в частности отсутствие канцерогенных и токсичес ких свойств, слабая антигенность, устойчивость к действию ряда фермен тов и др. Этим ребованиям биосовместимости в наибольшей степени отвечают носители белковой природы, на;пример сывороточный альбумин. Известен способ получения иммоби лизованного, трипсина с. использованием сывороточного альбумина человека, который заключается в связыва нии фермента с молекулами альбумина в растворенном состоянии, причем фермент предварительно обрабатывают глутаровым альдегидом. Процесс ведут при при следующих концентрация компонентов в реакционной смеси, мг/мл: трипсин 0,5; глутаровый альде гид 0,25-0,4; сывороточный альбумии 10, .При этом получают растворимые ассоциаты трипсина с сывороточным альбумином с молекулярной массой до 1- 10б 2 . Однако продукт,, получаемый этим способом,проявляет недостаточную устойчивость к тканевым ингибиторам и ингибиторам крови (13-53% - при концентрации сыворотки крови 0,1 мл на 1 мл {Реакционной смеси) . Целью изобретения является повышение устойчивости иммобилизо.ванного трипсина к тканевым ингибиторам и ингибиторам крови. Указанная цель достигается предлагаемым способом получения иммобилизованного трипсина, предусматривающим связывание фермента с сывороточным альбумине с помощью глутарового альдегида, причем сывороточный альбумин используют в форме частиц геля, а процесс ведут при путем обработки гелевых частиц глу.таровым альдегидом с последующим связыванием с ферментом при следующем соотнсж1ёнии компонентов в реакционной смеси, мас.%: гель альбумина 15-20; глутаровый альдегид 1-2; трипсин 3-5, Обычно используют частицы геля на основе водной смеси, содержащей, мас.%: сывороточный альбумин 4-5; глицерин 2-3, глутаровый альдегид 2-3. В результате трипсин связывается с твердыми частицами альбуминового геля. Получают не растворимое в воде производное трипсина. Конформацирнная стабильность молекул трипсина, фиксированных путем многоточечного закрепления на сетчатой структуре альбуминового геля, оказывается выше, чем в растворимых ассоциатах с лабильной конформацией по известному способу. Кроме того, при многоточечной фиксации на сетчатой структуре геля эффективно блокиРУются центры молекул трипсина, ответственные за взаимодействие с ингибиторами. В результате остаточная активность иммобилизованного трипсина поЬле действиясоевого ингибитора в . концентрации Qfl мг/мп составляет 60%, а после действия сыворотки крови в концентрации 0,4 мл на 1 мл смеси - 97%., Используемые по предлагаемому способу в качестве носителя частицы геля сывороточного альбумина получают путем нагревания .на кипящей водяной бане в течение 15-20 мин водной смеси, содержащей, мас.%: сывороточный альбумин человека 4-5; глицерин 2-3 гяутаровый альдегид 2-3) вода - до 100, с последующим измельчением,, Указанный ийтервал времени нагрева достаточен для перевода раствора альбумина в гель при минимальных затратах тепловой энергии. Такое соотношение ингредиентов подобрано, исходя из требований получения механически прочного геля при минимальном расходе сывороточного альбумина. Соотношение ингредиентов при иммобилизации установлено экспериментально из зависимостей активности нерастворимой формы трипсина от соотношения фермент - носитель, - г.. Указанные ингредиенты вводятся в последовательности: вода, гель сывороточного альбумина человека) глутаровый альдегид, трипсин, Пример, Гель сывороточного альбумина человека получают путем нагревания на кипящей бане в течение 15 мин смеси, содержащей, мас,%: Сывороточный альбумин человека4,5 Глутаровый альдегид 2,3 Глицерин2,3 ВодаДо 100

На практике, например для внутриполостного введения больному, ферментный препарат часто удобно использовать в виде; водной суспензии. Поэтому образовавшийся гель после охлаждения продавливают через сито с диаметром пор 250 мкм, а затем отсеивают частицы с размерами менее 50 мкм, используя сито с соответствующим диаметром пор. В результате п олучают фракцию частиц геля с размерами пор 50 - 250 мкм, которую многократно.промывают дистиллированной водой.

Иммобилизацию трипсина на частицах геля сывороточного альбумина проводят в водной среде при соотношений ингредиентов, мае.%

Трипсин3,8

Гель сывороточного

альбумина человека 18,9

Глутаровый альдегид 1,9

Вода. До 100

I Указанную смесь инкубируют при на протяжении 1. ч. После инкубации гель с иммобилизованным трипсином многократно промывают дй стиллированной водой, контролируя наличие белКа в растворе по поглощению при длине волны 280 нм в промывных врдах. Активность иммобилизованного и растворимого трипсина измеряют по Кунитцу в модификации М.П, ЧерникоBSL fз при этом в качестве субстрата используют казеин. Влияние ингибиторов на казеинолитическую активность . трипсина исследуют в опытах, в которых ферментный препарат и ингибитор инкубируют в течение 15 мин при 20°С. При этом сравнивают . показатели для водорастворимого трипсина и иммобилизованного препарата в виде водной суспензии.

Полу.ченные результаты представле0 ны в таблице, из которой становится очевидным, что иквдобилизованный на частицах геЛя сывороточного альбумина человека трипсин значительно устойчивее к действию ингибиторов тка5 ней и крови чем растворимый.

Использование изобретения позволит получать препараты трипсина с повышенной устойчивостью к тканевым ингибиторам и ингибиторам крови, что даст возможность достигнуть эффекта пролонгирования действия препарата при его применении в терапии гнойно-воспалительных процессов и за счет уменьшения числа повторных введений препарата больным уменьшить степень травмирования тканей, больного, снизить затраты на лекарственные препараты при лечении (экономия фермента, обезболивашедих и антисептических средств и т.д.), а также снизить затраты труда и времени обслуживающего персонала.

1. СПОСОВ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОВИЛИЗОВАННОГО ТРИПСИНА, предусматривающий связывание трипсина с сывороточньв4 альбумином с помощью глутаро- . Вого альдегида, о т л и ч а ю ut -и йс я тем, что, с целью повьшения устойчивести получаемого продукта к тканевым ингибиторам и ингибиторам крови, сывороточный альбуминиспользуют в форме частиц геля и процесс ведут при путем обработки гелевых частиц глутаровым альдегидом с последующим связыванием с ферментом при следуюцем соотисхйении компонентов в реакциониой смеси, мас, Гель альбумина 15-20 Глутаровый альдегид 1-2 Трипсин3-5 2. Способ по п. 1, от ли ч а-ю щ и и с я тем, что -используют частицы геля на основе водной смеси, содержащей, мас.%: : Сывороточный альбумин 4-5 Глицерин2-3 Глутаровый альдегид 2-3

Ингибитор трипсина из бобов