Способ получения иммобилизованного осахаривающего ферментного препарата Советский патент 1982 года по МПК C12N11/00 C13K1/06 C12N9/24 

(54) СЛОГОВ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ОСАХАРИВАЮЩЕГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА . :, Изобретение относится к шособам получения нерастворимых ферментных препаратов, . в частности препаратов, полученных на основе осахаривающкх ферментов - амнлоглюкозадазы и a-a dилaзы, которые находят применение В пищевой и смежных с ней отраслях. Процесс превращения в нерастворимое cotтояние (или иммобилизация) внеклеточных и внутриклеточных растворимых в воде ферментов, т. е. фиксация каталически активных (На тивных) фермЬнтов в твердых или кваэвтв р дых, формованных или обладающих способ- ностью формоваться структурах, становится все более важным в технологическом, а также в экономическом отношении, посколг ку он может рассматриваться как средство, позволя .няцее повторно) использовать измельченный фермент в процессах периодического действия или применять его в непрерьганом в так назьшаемьгх энзимных реакторах. В течение последних лет значительные усилия бьши направлены на развитие технологии иммобилизации в промышленности по производству крахмала, что связано с производством таких продуктов, как высококонценгрированные сиропы декстрозы и фруктозы. Недавно в пищевой и родственных ей отраслях промышленности возросла относительная значимость второго из указанных двух продуктов, причем высоко концентрированные сиропы фруктозы преимущественно вытесняют сироп сахарозы,и менее сладкий высококонцентрированный сироп декстрозы. Два дополнительных типа сахарного сиропа, полученных гидролизом крахмала и содержащих значительное количество мальтозы (т.е. сиропы с высоким содержанием мальтозы и высокой степенью конверсии) используются во все возрастающей степени особенно в кондитерской (твердые леденцы) и консервной промышленности. Полный промышленный процесс превращёння крахмала через стадию образования сжропа с высоким содержанием декстрозы в сироп с высоким содержанием фруктозы -включает три последовательные стадии, а именно процесс разбавления или разжижения крахмала В декстрины, катализируемый кислотой (или бактериальной, а-амилазой, последующего 392 осахаривания их до сиропа с высоким содержанием декстрозы и превращения последнего в сироп с высоким содержанием фруктозы, причем каждый процесс катализируют специфическим для него ферментом, а именно амилоглюкозидазой и глюкозоизомеразой соответственно. В то время, как в результате ряда недавно проведенных технологических разработок стало возможным и первую, и третью стадии указанной последовательности осуществлять непрерывно, промышленное осахаривание (т, е. вторая стадия) преимущественно еще остается процессом периодического действия. Сироп с высоким содержанием мальтозы также можно получить из крахмала. Осахаривание разжиженного крахмала, в результате которого получают сироп с высоким содержанием мальтозы (и обычно содержащий относительно небольшое количество глюкозы), осуществляют с помощью малыогенной амилазы, предпочтительно грибковой а-амилазы. Подобно гликогенному осахариванию соответствующий мальтогенга)1й процесс обычно осуществляют как периодический процесс с исполь зованием растворимого фермента. Хотя предпочтительность полностью непрерьш ного процесса очевидна, совершенствование конструкций промышленного ферментативного реактора, основанных на использовании на стадии осахаривания иммобилизованной амило глюкозидазы, находится на начальной стадии. Известно несколько способов иммобилизации осахаривающих ферментов, например, амилоглюкозидазы, связыванием фермента с нераст воримым органическим или неорганическим носителем. Однако только немногие из зтих способов вышли за пределы лабораторной прак тики. Известен, например, способ получения иммоби лизованного осахаривающего ферментного препа рата на основе амилоглюкозидазы путем ковалентного связьшания ее с пористыми частицами стеклянных или керамических материалов с по мощью глутарового альдегида. Частицы носителя со средним диаметром пор около 400 А помещают в колонку и последовательно пропускают через нее раствор глутарового альдегида и раствор фермента. Получаемый продукт используется в непрерьтном процессе осахаривания. Колонку опытной заводской установки заполняют полученным измельченным прераратом фермента и заливают растворами вьшускаемых промышленностью декстринов. Достигается степень превращения в декстрозу, которая приближается к 92%, что обычно реализуется в процессах периодического осахаривания с растворимой амилоглюкозидазой. Однако в отличие от периодического процесса, в котором используется свободный энзи случае процесса в колонке степень вазиморевращений, т. е. повторной полимеризации глюкозы в мальтозу, изомальтозу и более ысокие олигомеры, катализируемой амилоглюозидазей, довольно высока (10%). Повышеное взаимопревращение, с которым сталкиваются при использовании иммобилизованного энзимного препарата зтого типа, по-видимому здстично обусловлено применением пористых энзимных носителей. Очевидно пористая структура в очень значительной степени увеличивает бщую площадь поверхности, обусловливая максимальное связывание энзимов, и, следовательно, максимальную фepмeнтatивнyю активность получаемого иммобилизованного ферментного препарата (1 . Однако сочетание высокой концентрации фермента, связанного с поверхностью пор носителя, и пониженной скорости диффузии в пределах пор неизбежно приводит к локально высоким концентрациям глюкозы, что создает благоприятные условия для ускорения ферментативных процессов с высокими Кмзначениями (т. е. нежелательных реакций взаимопревращений, особенно тех, которые приводят к образованию изомальтозы и изомальтриозы). Целью, изобретения является улучшение качества получаемого иммобилизованного ферментного препарата, обуславливающее снижение образования продуктов побочной полимеризации при использовании полученного препарата в процессе осахаривания. При этом рабочие характеристики получаемого препарата должны быть существенно приближены к характеристикам., растворимого фермента независимо от того, используется ли иммобилизованный препарат в процессе периодического действия или в процессе с непрерывной схемой. В случае иммобилизованного препарата амилоглюкозидазы это требование ведет к тому, что непрерывный процесс осахаривания может осуществляться при таких особо предпочтительных условиях (например при таком составе и скорости подачи декстрина), при которых концентрация глюкозы на выходе равна 92%, причем суммарная концентрация дисахаридов (мальтозы и изомальтозы) и трисахаридов (в основном панозы и изомальтотриозы) не превосходила бы примерно 4 и 1% соответственно. В случае иммобилизованной мальтогенной а -амилазы необходимыми параметрами конверсии являются следующие: мальтоза примерно 40-60%; мальтотриоза 25-35% и глюкоза менее 10%. Указанная цель лостигается тем, что согласно способу получения иммобилизованного

осахаривающего ферментного препарата связывания фермента с нерастворимым носителем с помощью глутарового альдегида в качестве носителя используют гранулированный казеин, процесс связывания осущетсвляют при s перемешивании в водной среде ори дополнительном присутствии яичного альбумина при следующих соотношениях компонентов: фермент:носитель (0,02-0,2) фермент:альбумин (0,2-1,5) глутаровьш альдегид:фер- Ю мент с альбумином (02,-0,4): и содержании воды в реакционней смеси 30-60 вес.% с последующими механическим, дроблением полученного продукта и сушкой.

В качестве осахаривающего фермента используют амилоглюкозидазу или о-амилазу.

Глутаровьш альдегид обычно используют в виде 50%-ного водного раствора.

Предпочтительньш размер частиц казеина составляет 00-500 мкм.20

Получемый по изобретению продукт представляет собой частицы носителя, т. е. гранулированный казеин, покрытые белковым слоем альбумина, проницаемым для жидкости, ив зтом слое г осахаривающий фермент поперечно сшит с альбумином яйца с помощью глутарового альдегида.

Способ осуществляется следующим образом.

Тщательно перемешиваемую сухую смесь 30 гранулированного казеина и порошка альбумина яйца соединяют с водной смесью, содержащей осахаривающий фермент и глутаровый альдегид, растворенные при рН 4-7, причем альбумин может быть произвольно растворен 35 с этими компонентами вместо смешения его в сухом состоянии с казеином, вьщерживают полученную смесь в спокойном состоянии, как правило, при температуре окружающей среды, чтобы завершить покрытие носителя 40 белковым слоем и процесс сщивания поперечными связями белка. Смещение может осуществляться или вручную, например путем тщательного перемешивания и измельчения в ступе, путем тщательного перемешивания и измель- 45 чения выступе, или механически, например в горизонтальной мешалке отвального типа, поставляемой формой Людиге Машиненбау, За11адная Германия, или в аналогичного типа выпускаемых промышленностью мешалках.50 , Содержание воды в смеси должно составлять 30-60 вес.%.

Важное значение имеют свойства гранулированного казеинового продукта, используемого в качестве материала носителя. Так, гранулы . казеина должны обладать значительной физической прочностью, чтобы обладать способностью противостоять значительным деформациям, возникающим при намачивании насадки-колонки.

Кроме того, степень набухания в воде должна быть разумно 1ШЗКОЙ, предпочтительно не должна превьпиать 200%. Примером продукта, который удовлетворяет указанным требования может служить гранулированный казеин, осажденный кислотой. Пищевые сорта продук1ов этого типа, предпочтительно имеющие размер частиц 00-500 мкм, могут j быть, получены из различных источников, например они выпускаются французской Компанией Сцерма С. Сканированием в электронном микроскопе уста;новлено, .что поверхность таких частиц имеет очень изогнутую и нерпавильную форму, lanoминающую макроскопический вид пемзы. Веро ятно такая похверностная микроструктура обладает больйжм числом связующих 5 астков для глутарового альдегида.

Для осуществления изобретения важным обстоятельством является то, что альбумин, применяемый в качестве связующего белка, практически мгновенно растворяется в воде. Отсюда предпочтительным сортом альбумина является обычный высушенный распыле1шем продукт.

в процессе смешения может происходить определенная степень агломерации покрытых частиц, что приводит к завершению реакции поперечного сшивания при образовании влажного, крупногранулированного и кускового продукта. Этот продукт- должен быть подаертнут в дальнейшем измельчению, например, путем гранулирования с образованием измельченного продукта с размером частиц в предпочтительном диапазоне. Гранулирование может осуществляться на колеблющемся: грануляторе типа, который поставляется рядом Компаний (фирма Диаф, Копенгаген, или фирма Маности, Ливерпуль). Гранулированный продукт пропускают через сита, например, с размером отверстий 1-2 мм, и он может быть освобожден от тонкого материала стандартными способами., Полученный продукт может быть npoMbiT и затем высущен до требуемого содержания воды. I.

Перед применением в процессе осахаривания высушенный ферментный продукт обычно улуоиашт, для чего предварительно вымачивают его в водном растворе. На этой стадии,.а также на начальной стадии последующего использования может происходить определенное уменьше ше активности фермента. Найдено, что включение дополнительной стадии поперечной сшивки . произвольно в сочетании с процессом намачивания может привести к значительному снижению указа1шой потери активности фермента. Отсюда, в соответствии с предпочтительным вариантом воплощения изобретение осуществляют предварительную обработку ферментативного препарата водным раствором, содержащим приемлемое количество глутарового альдегида, предпочтитель но от 0,5 до 5%, с последующим, как правило, удалением избытка реагента путем промьюки и извлечением высушенного препарата. Дополнительно установлено, что при предварительной обработке ферментативного продукта солью сернистой кислоты может достигаться значительное увеличение степени превращения (выраже1шой в процентах декстрозного эквивалента или величиной ДЕ) осахаренного прод}п та. Сульфитное действие весьма вероятно связано с раскрытием определенных сетчатых структур, включающих белковый ферментативно-активный слой, но, по-видимому, без связывания энзима, что тем самым облегчает доступ более высокомолекулярных олигосахвридов к активным участкам фермента. Таким образом, предпочтительна обработка (ферментативного продукта разбавленным водным раствором сульфита, содержащим 0,1- 2% сульфита натрия при рН 4-5. Сульфитную обработку предпочтительно проводят при комнатной температуре и обычно прерывают через 120 мин промывкой водой с последующим извлечением высущенного продукта. Установлено, что после обработки сульфитом не происходит потери активностиf фермента. Ферментные препараты, приготовленные в соответствии с описанной процедурой, могут использоваться в процессе осахаривания либо периодического действия, включающем отделение и повторное использование ферментативного препарата, либо непрерьшного действия в ферментативном реакторе. Амилоглюкозидазу получают культивированием щтаммов, принадлежащих к виду Aspergillus или Rizopus, т. е. Aspergillus niger или Rizopus delemar. Мальтогенную а -амилазу пред почтительно получают из штаммов Aspergillqs oryzea. Определение активности амилоглюкозидазы При стандартных условиях, т. е. при рН 4,5 и температуре 55,0° С, определяют удельную активность растворимой амилоглюкозидазы, а также удельную активность иммобилизованного фермента, которая определяется как количество фермента или ферментативного продукт которое гидролизует водный раствор, содержащий 30% (вес.об) мальтозы, с начальной скоростью 1 мкмоль мальтозы в минуту. Активность иммобилизованного фермента определяю в процессе периодического действия на образц который поддерживают в суспензированном состоянии с помощью встряхивающего устройства. Определение активности грибковой а -амил При стандартных условиях, а именно при рН 5,6-5,7, температуре 37,oio,05°C и в при сутствии 4,3 ммолей Са -ионов, определяют удельную активность растворимой а-амилазы, а также удельную активность иммобилизованного фермента, выражаемьк как количество фермента или фермоггативного продукта, которое гидролизует раствор, содержавши растворимый Крахмал (марки Мерк Амияум солюбиле, ДАВ, Erg. 8. Vf), (6,95 г на 000 мл) с начальной скоростью 5,26 мг к ахмала в час. Для контроля за реакцией следят за образованием голубой окраски с йодом. При разрушении эмульсии крахмала эта окраска становится слабее и постепенно превращается в красновато-коричневую. Изменение цвета контролируют визуально сравнением с окрашешп 1ми стеклянными стандартами. Активность иммобилизованного фермента проверяют п{ш условиях, аналогачных тем, которые указаны дЕцуяа милоглюкозидазы., В растворимых осахаривающих ферментов используются вьтускаемые промьппленностью амилоглюкозидаза Ново ISO и Фунгамил 1600 (Фунгамил- патентова1шое; торговое название продукта). Первый, который продается в виде водного раствора, обычно превращают в высушенный в струе порошок перед его использованием. Процессу сушки может предшествовать ультрафильтрование , обычно объединяемое с процедурой промьтки для удаления низкомолекулярных примесей. При применении процессов концентрирования и очистки, хорошо известных специалистам в данной области, легко может быть получен твердый амилоглюкозидазный продукт с активностью 5000 ед. на грамм или более высокой активностью. Фунгамил 1600, поступающий в продажу в . виде порошка, имеет активность 1600 ед. на грамм. Может быть использован как Непосредственно коммерческий препарат, так и препарат,, подвергнутый дополнительному концентрирова;нию и очистке. Полное извлечение активности в иммобилизованном осахаривающем ферментативном npojoyKTe зависит от конкретных параметров процесса иммобилизации, но составляет обычно не менее 40%. Субстратом в процессе осахаривання,, осуществляемом с помощью иммобилизованного ферментативного препарата в соответствии с изобретением, может служить любой олигосахарид, претерпевающий осахаривание в присутствш соответствующего растворимого фермента. Примерами предпочтительньк субстратов могут служкть декстрины, получаемые кислотным и/или ферментативным разжижением крахмала и характеризуемые ДЕ-величинами, равнымп 5-40; высококонцентрированные сиропы мальтозы (с ДЕ-величинами от 35 до 60) к остаточные олигосахариды, остающиеся в маточной жидкости после кристаллизации декстрозы юта в рафинатах, получаемых при фракиконировани фруктозы и глюкозы. Предпо тгительны раство декстрина с содержанием сухого вещества в пределах от 20 до 55% (вес.об.). - ц-р и м с р 1. Относительно низкосортны гранулированный казеин, осажденный соляной кислотой (9 г пшцевого казеина, вьшускаемого фирмой Сцерма С. А., Франция, и содержащего частицы размером 100-500 мкм, причем фракция от 300 до 500 мкм составляет примерно 60%) смешивают с промьшшенньо яичным альбумином, подвергнутым струевой , сушке (1,2 г). К этой смеси добавляют предварительно смешанный раствор порошка амилоглюкозидазы (6,5 ь.т 18,5%-ного водного раствора), содержащего в сумме 12500 ед. амилоглюкозидазь и глутаровый альдегид (1,2 мл 50%-ного водного раствора). Порошок амилоглюкозидазы представляет собой ультрафильтрованный вь4сушенный в струе продукт, приготовленньш из амилоглюкозидазы Ново (Ново индастри A/S, Дания). Смесь тщательно измельчают в ступе и затем выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч. Получаемые агрегаты измельчают в ступе с получением гранулированного продукта, которому дают возможность высохнуть при комнатной температуре в течение одного дня. Активность высушенного гранулированного продукта (11,4 г) составляет 425 ед. на грамм, что составляет 38,8%. Пример 2. Гранулированный кислотой осажденный казеин (1500 г типа М 60 Сцерма С. А., содержащего частицы размером 100-500 мкм, причем фракция от 150 до 350 мкм составляет примерно 70%) смешивают в сухом состоянии с продажным высушенным в струе альбумином (120 г) в 20-литровой горизонтальной мешалке. Ультрафильтрованный концентрат амилоглюкозидазы, приготовленный из Амилоглюкозидазы Ново (650 г раствора, содержащего примерно 25% сухого вещества и примерно 3200 ед. растворимой амилоглюкозидазы в 1 Г концентрата), тщательно смешивают с глутаровым альдегидом (180 мл 50%-ного водного раствора) при рН 4,9 и при температуре , Полученный раствор вливают в смеситель. Тщательное перемешивание осуществляют в течение еще полминуты или одной минуты, а затем влажный осажденный продукт удаляют из смесителя. .Влажный продукт оставляют, в покое примерно 45 мин .для завершения процесса образования поперечных связей, в результате чего образуются куски агрегированньк частиц. Гранулирование продукта осуществляют на колеблющемся грануляторе (например типа, поставляемого фирмой Диаф A/S, Копеэтаген), снабженном ситами с отверстиями 1,5 мм. Гранулированный продукт промывают обессоленной водой (10 л) в течение 10 мин, извлекают фильтрованием и затем подвергают сушке в кипящем слое. Высушенный продукт (1600 г, 450 ед. амилоглюкозидазы на грамм) освобождают от тонких частиц просеиванием. Пример 3. В 400 мл водопроводной воды готовят раствор 105 г высушенного в струе порошка амилоглюкозидазы, полученной по примеру 1, и 105 г высушенного распылением альбумина и оставляют его на ночь в холодильнике при 6-7° С, рН раствора 5,4. Затем добавляют глутаровый альдегид (100 мл 50%-ного водного раствора) и полученный раствор добавляют в течение 3 мин к тщательно перемешиваемой ( навеске гранулированного соляной кислотой осажденного казеина (725 г того же сорта, что и применяемый в примере 1). Смешение ос)тцествляют в промышленной мешалке типа, используемого в примере 2. Тщательное перемешивание смеси продолжают в течение нескольких минут, после чего ее оставляют в покое примерно 1 ч для завершения реакции образования поперечных связей. Полученные агрегаты и кусковой продукт гранулируют на колеблющемся грануляторе через сито диаметром 2 мм. Гранулированный продукт промьшают водH iM раствором ацетата натрия (2рН 4,2) и затем сушат в вакууме при 35° С. Активность высушенного гранулированного продукта (925 г) равна 800 ед. на грамм, что соответствует 67,8% первоначальной активности. Пример 4. Иммобилизованный амилоглюкозидазный продукт, приготовленный по примеру 3 (20 г), вымачивают при комнатной температуре в течение 1 ч в водном растворе глутарового альдегида (500 мл 1%-ного раствора, регулируемого до рН 7,0), после чего осуществляют извлечение высушенного продукта (20 г)., : , . . Активность полученного продукта 625 една грамм, т, е. на второй стадии иммобилизации относительная активность составляет 7%, а полное извлечение из растворимой амилоглюкозидазы - 53%. , Пример 5, Водный раствор мальтогенненной альфа-амилазы (2 мл 5%-ного раствора унгамила 1600 (Ново Индастри A/S, Дания) деионизированной воде при рН 6,2) смешиают с водным раствором глутарового альдеида (0,3 мл 50%-ного раствора) и затем ыстро добавляют к сухой смеси гранулированого кислотой осажденного казеина (4/0 г ипа М 60) и промышле1того яичного альбуина, высушенного распылением (0,5 г). 119 После тщательного измельчения в ступе полученный продукт выдерживают 1 я при ком ватной температуре. Куски измельчают в ступе после чего продукт сугиат при комнатной температуре в течение одного дня. Пример 6. Колонку диаметром 15 м снабженную рубаижой и поддерживаемую при 55 С, загружают 5,7 г иммобилизованного амилоглюкозидазного продукта, приготовленно го по прнмеру 1. В колонку подают с постоянной скоростью 15 мл в час сверху вниз сьфье, содержащее 30% (вес. об.) промыщленного кислотой (фер ментом гидролизованного декстрина (СРС iCHoy Флзйк Малтодекстрин 01915 Д.Е.20), имеющего следующий примерный састав, %: Глюкоза4-5 Дисахариды. 8-9 Трисахариды6-7 Тетра-и олигосахариды 79-82 к которому добавляют 0,2% (вес.%) сульфита натрия и затем регулируют рН до 4,5. Вытекающий поток анализируют методом жидкостной хроматографии при высоком давлении (МЖХВД). Полученные данные представлены в табл. 1. Пример 7. В колонку диаметром 25 мм, (жабженную рубаижой и поддерживаемую при температуре 55° С, загружают иммобилизованный амилоглюкозидазный продукт (20 г), приготовленный По примеру 2. В колонку снизу вверх подают сырье той же концентрации, того же состава и рН, которое используется в примере 6. Скорость подачи постоянна и равняется 50 мл. в час. Бексокиназным методом определяют содержание глюкозы. Полученные данные указаны в табл.2 Пример 8. В колонку с внутренним диаметром 25 мм, снабженную рубащкой и под f f. иммобилизованный амилоглюкозидазный про дукт (25 г), приготовленный по примеру 2, В колонку подают снизу вверх сырье состава. используемого в примере 6. Сырье (рН 4,5) содержит сухого твердого вещества 30% (вес. вес.) и с добавками 2 г на литр сорбата кали в качестве противостарителя. Скорость потока регулируют таким образом, ятобы поддерживат примерно постоянную степень превращения. Вытекающий поток анализируют МЖХВД. Определяют величину конверсии глюкозы в зависимости от времени. Данные представлены в табл. 3. После, заверщения эксперимента не отмечается никаких изменений твердости и других физических свойств материала насадки колонки. Пример 9. Следуя процедуре примера 7, но заменив иммобилизовашп ш амилоi12глюкози/щый продукт примера 2 тем, который приготовлен пго примеру 4, получают результаты, представленные в табл. 4. Пример 10. Иммобилизованную мальтогенную альфа-амилазу, приготовленную по методике примера 5 (4 г), загружают в колонку срубзш гой, поддерживаемую при температуре 4 5 С и подают- сверху вниз сырье - промышленный декстрин (СПС Сноу Флэйк Мальтодекстркн 0191.3), содержащий Wf (вес.об) твердого сухого вещества и 0, сульфита натрия в качестве противостарителя. рН сырья регулируют до 4,5 и скорость потока устанавливают равной 15 мл в часъ В табл. 5 указан состав вытекающего из колонки потока, причем дисахариды представлены главным образом мальтозой. П р и м е р 11. А). В колонку с внутренним диаметром 15 мм, снабженную рубаш,кой и поддерживаемую при температуре 55° С, загружают 12 г иммобилизованной амилоглюкозидазы, приготовленной по методике примера 2. I В колонку подают сверху вниз декстриновое сырье (31% (вес/вес), в расчете на содержание сухого вещества), приготовленное расжижением крахмала с Термамилом L 60 (торговое название, фирмы Ново Индастри A/S, Дания), и имеющего следующий состава,%: Глюкоза1 Шс&харишл. 7-8 Трисзхариды .10-12 Тетра-и олигосахариды79-82 Д. Е.21 В сырье в качестве противостарителя добавляют 0,2% (вес./об.) сульфита натрия, и сырье имеет рН 4. Поток .регулируют таким образом, чтобы прддерживата ПОСТОЯННУЮ степень конверсииСнсходя из продентного дер я глюкозы). Вытекающий поток анализируют МЖХВД. В табл. 6 представлены полученные результаты. в). Декстриновый субстрат, приготовленный по методу, описанному в разделе (А) и имеющий следующий состав,%: Глюкоза1,1 Дисахариды6,8 Трисаадриды11,0 Тетра-и олигосахариды:81,0 обрабатывают 0,01%-ной (из рассчета на содержание сухого таердого вещества) мальтогенной альфа-амилазой (Фунгамил 1600, Ново-Индастри A/S) при рН 5,0 и при в течение 2 ч. После обработки ползпают следующий состав субстрата,%: Глюкоза1,3 Дисахариды13,9 Трисахариды22,3 Тетра-и олигосахариды62,5 Каждую из двух колонок с внутрешшм диаметром 15 мм, имеющих рубашкуи подд живаемых при температуре 55° С, загружают иммобилизованной амилоглюкозидазой (10 г приготовленной по примеру 2).. В колонки п дают сырье сверху вниз, причем сырые содержит 30% (вес./об.) декстрина двух типов, приготовленных в соответствии с данным опи санием, к декстрину добавляют 0,2% (вес./об сорбата калия, и значение рН устанавливают равным 4,5. . 1у{аксимальная ДХ-величина на выходе пере обработкой декстрина фунгамилом равна 92,7%, а максимальная ДХ-величина на выходе после обработки декстрина фунгамилом 93,3%. Пример 12. 10 г порции иммобилизованной амилогйюкозидазы, приготовленной по методике примера 2, размачивают в 100 м растворов, содержащих различные концентрации сульфита натрия. рН раствора доводят до 4,5 добавлением уксусной кислоты. После размачивания В течение 2ч при комнатной температуре образцы ферментов промьтают деионизированной водой и загружают в колон ки с внутренним диаметром 15 мм, снабженные рубашкой и поддерживаемые при 55°С. В колонки подают сверху вниз потоки сырья, содержащего декстрин 30% (вес./об.), приготовленный по методике примера ПА и к которому добавлено 0,2% (вес./об.) сорбата калия с последующей регулировкой рН до 4,5. Путем регулирования скорости потока в каждой колонке из условия достижения максимума ДХ-значения на выходе получают следующие результаты: Сульфит натрия.Максимальное ДХ г/100 мл% О90,3 0,0 f90,2 , 0,191,2 0,291,7 0,591,9 1,092,4 Пример 13. Поток, собранный на выходе из колонки с иммобилизованным фунгамилом примера ,10 с высоким содержанием мальтозы (Д.Е. примерно 42), используют в качестве сырья для колонки из примера б с иммобилизованной амилоглюкозядазой. Скорость потока регулируют (до 73 мл в час) так, чтобы на выходе иметь сироп с высокой конверсией (Д.Е. примерно 65), имеющий следующий сосхав,%: Глюкоза 38,1 Дисахариды39,6 Трисахариды2,8 Тетра-и олигосахариды19,6 Пример 14. В колонку, имеющую внутренний диаметр 25 мм и снабженную рубаиткой, при температуре 55° С загружают иммобил1гзованный амилоглюкозидазный продукт (20 г), приготовленный по примеру 3, В колонку снизу вверх подают сырье, содерркащее маточную жидкость (или рафинат), пол)П1енную из фруктозо-глюкозного фракционирования, имеющее следующий состав, %: Фруктоза : 3 25 Глюкоза85,71 Дисахариды9,17 Трисахарвды,42 Более высокие сахариды0,54 Причем рН доводят до 4,5, а скорость потока через колонку равняется 250 мл в час при концентрации 25% (вес.вес.). Состав на выходе из колонки, определенный МЖХВД, следующий,%: Фруктоза3,25 Глюкоза91,16 Дисахариды4,14 Трисахариды1,15 Более высокие сахариды0,30 Преим тцеством предлагаемого изобретения вляется относительно низкая стоимость получамых препаратов, так как их получение осноано на использовании сравнительно недороостоящих промышлешю легко получаемых осителей и других вспомогательных материаов.

5,6 4.2

92,0 93.2

3.9

92 3.2 93,6

3,1

933 3.2 92,6

2.9

92,6

I

Дни

1

.

1.7 2,0

95.3 95.8

2.5

95.4 95,8

2,5

2.9 3,3

95,5 94.9

94

3,6

Таблица 2 Содержание глюкозы, %

89.0 93,6 93,6 93.1

Таблица. 3

Содержание глюкозы.

101

92,4 Скорость потока, мл/ч

17

9 10

Дни

13

921470

18 Продолжение табл.3

60 57

92,0

Таблица 4

Содержание глюкозы,

93,3

3,6

92,3

92,2 92,4 3,1

3,3

92,1

56

Формула изобретения I. Способ получения иммобилизованного осахаривающего ферментного препарата путем связьгеания осахаривающего фермента с нераст воримым носителем с помощью глутаровото альдегида, отличающийся тем, что, с целью улучшения качества целевого про дукта. в качестве носителя используют гранулированный казеин, а связывание осуществляют при перемешивании в водной среде при дополнительном присутствии яичного альбумина при следующих соотношениях компонентов: фермент: носитель (0.02-0.2) фермент: альбумин (0,2-1,5) глутаровьй-альдегид: фермент с альбумином (0.2-0,4): и содержа,нии воды в реакционной смеси 30-60 вес.% с последующими механическим дроблением полученного продукта и сушкой.

3,3

33

3,5

27 18 3,6

3,7

15

« -амилазу.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

-, I .-;

1. D. D, Lee, J. J. Lee, G. Т. Tsao. Continuons Production of Glucose from Dektrin by Glucoamylase tmmobitized on Porous SJIica DieStarke-, 1975. Nr. 1, 27. 384-387 (про.тотип).