СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ АЛКОГОЛЬОКСИДАЗЫ Российский патент 1994 года по МПК C12N11/08 G01N27/40 

Изобретение относится к способам иммобилизации ферментов, а именно к технологии получения иммобилизованной алкогольоксидазы, которая используется в анализаторах для определения этилового спирта в крови и других биологических растворах.

Известны способы получения иммобилизованных ферментов путем включения фермента в пространственную структуру гелей, например, альбуминового геля в присутствии глутарового альдегида [1] .

Недостаток этого способа связан с трудностью регулировать прочность и эластичность геля, содержащего фермент.

Известен способ иммобилизации ферментов путем их связывания с нерастворимым пленочным носителем в присутствии сывороточного альбумина и глутарового альдегида [2] , но он тоже не обеспечивает высокого качества иммобилизованной алкогольоксидазы.

Недостатком способа является ограниченная применимость, так как полученная этим способом иммобилизованная алкогольоксидаза при использовании в анализаторах определения этилового спирта не отличается высокой активностью и стабильностью. По-видимому алкогольоксидаза быстро инактивируется под действием глутарового альдегида.

Наиболее близким к изобретению является способ иммобилизации алкогольоксидазы при pH 8,0-9,0, включающий введение алкогольоксидазы в гелевую структуру, содержащую сывороточный альбумин, глутаровый альдегид и азид натрия в буферном растворе, и последующее нанесение на лавсановую мембрану - ядерный фильтр [3] . Сущность способа объясняется тем, что азид натрия комплексируется в активном центре алкогольоксидазы.

Недостатком способа является сравнительно низкое качество целевого продукта: иммобилизованная алкогольоксидаза при использовании в анализаторах определения этилового спирта отличается сравнительно низкой активностью и стабильностью (см. табл. 1).

Цель изобретения - повышение активности и стабильности иммобилизованной алкогольоксидазы.

Способ заключается в том, что при иммобилизации алкогольоксидазы путем включения фермента в гелевую структуру, содержащую сывороточный альбумин, глутаровый альдегид и азид натрия в коцентрации 0,25-500 мМ, в буферном растворе, pH 8,0-9,0, и последующего нанесения его на лавсановую мембрану - ядерный фильтр, в гелевую структуру дополнительно вводят комплекс меди и гистадина Cu (His) в концентрации (0,5-1,5) мг/мл.

Сущность способа может быть объяснена тем, что в активном центре алкогольоксидазы значительная часть флавинадениндинуклеотидов (Е-ФАД) является в семихиноновом состоянии (E-ФАД. ), т. е. приблизительно шесть из восьми. При хранении фермента флавинадениндинуклеотидсемихинон претерпевает редокс превращение с образованием супероксидрадикала (O₂^-. ):
Е-ФАД^-. +O₂ --- E-ФАД+O₂^-.

Образовавшийся радикал O₂^-. является очень реактивным агентом, который разрушает четвертичную структуру фермента и приводит к его инактивации. Дополнительно используемый в процессе иммобилизации комплекс Cu(His) моделирует активный центр супероксиддисмутазы, элиминирующий O₂^-. , что и обеспечивает повышение активности иммобилизованной алкогольоксидазы.

Комплекс меди и гистидина получают по методике, описанной в литературе.

Для иммобилизации используют алкогольоксидазу из Candida boidinii или Pichia pastoris.

П р и м е р 1. 0,1 М раствор CuSO₄ смешивают с 10% избытком 0,1 М раствора гистидина. Спектрофотометрически наблюдают появление полосы поглощения при 610 нм. Методом спектрофотометрического титрования установлено, что образуется комплекс гистидина и меди в соотношении 2: 1.

П р и м е р 2. 0,1 мл алкогольоксидазы (500 U/мл), 8 мл бычьего сывороточного альбумина растворяют в 0,1 мл 0,01 М фосфатного буфера pH 8,0, cодержащего 0,1 М KCl, 1 мМ ЭДТА, 50 мМ азида натрия и 1 мг/мл Cu (His). В раствор добавляют 0,02 мл 5% глутарового альдегида, смесь тщательно перемешивают и выливают на лавсановую мембрану (ядерный фильтр) проницаемостью 10,7 % и диаметром пор 0,16 мкм, площадью 9 см². Для получения ферментной мембраны, применяемой в анализаторах для определения этилового спирта, на поверхность приготовленной двухслойной мембраны надевают ацетатцеллюлозную мембрану толщиной 10 мкм. Полученную трехслойную мембрану с каплей буфера помещают в холодильник на сутки, затем надевают на электрод и тщательно отмыв струей буфера определяют ток ферментного электрода при pH 8,0 при 0,6 В отн. Ag/AgCl электрода сравнения.

Аналогично проводят иммобилизацию алкогольоксидазы с использованием комплекса Cu(His) в концентрации 0,5 и 1,5 мг/мл или в отсутствии комплекса по известному способу. Готовят аналогичные примеру 2 ферментные электроды.

В табл. 1 приведены сравнительные параметры полученных электродов. Измерения проведены в 0,01 М фосфатном буфере (0,1 М KCl, 1 мМ ЭДТА), pH 8,0.

Из табл. 1 видно, что при тех же концентрациях этилового спирта плотность тока или чувствительность электродов (2-4), содержащих иммобилизованные мембраны согласно предлагаемому способу, гораздо выше, чем содержащих мембрану (1), приготовленную согласно прототипу. Повышение активности иммобилизованной алкогольоксидазы обеспечивается при концентрациях Cu(His) 0,5-1,5 мг/мл. Однако наилучшие результаты реализации способа получены при концентрации комплекса 1 мг/мл, так как плотность тока электрода, изготовленного на основе этой иммобилизованной алкогольоксидазы, при всех концентрациях алкоголя (в интервале 5-80 мМ) увеличивается в 3,6-4,6 раза по сравнению с прототипом (ср. например, плотность тока при концентрации алкоголя 70 мМ равную 40,04 и 8,63 соответственно).

П р и м е р 3. Для определения стабильности иммобилизованной алкогольосидазы изготавливают электроды с ферментными мембранами, изготовленными по предложенному способу с использованием комплекса Cu(His) в концентрации 1 мг/мл и по прототипу, и определяют зависимость тока электродов от продолжительности хранения. Полученные результаты приведены в табл. 2. (концентрация этилового спирта в ячейки 0,5 мМ, другие условия как в примере 2). Ферментная мембрана хранится в холодильнике.

Из табл. 2 видно, что в течение 4 мес эксплуатации чувствительность электрода, приготовленного на основе иммобилизованной глюкозооксидазы по данному способу, уменьшается на 30% , тогда как мембрана, приготовленная по прототипу, за этом время полностью теряет активность, а в течение одного месяца на 50% . (56) 1. Ю. Ю. Кулис. Аналитические системы на основании иммобилизованных ферментов. Вильнюс, "Мокслас", 1981, с. 8-23.

2. Авторское свидетельство СССР N 1326978, кл. G 01 N 27/46, 1989.

3. Авторское свидетельство СССР N 1615179, кл. C 12 N 11/08, 1990.

Использование: биохимия, в частности в анализаторах для определения метаболитов в крови и других биологических растворах. Сущность изобретения: при введении фермента в гелевую структуру, содержащую альбумин, глутаровый альдегид и азид натрия, дополнительно вводят комплекс меди и гистидина Cu(His) в концентрации 0,5 - 1,5 мг/мл. Положительный эффект: активность иммобилизованного фермента увеличивается в 3,6 - 4,6 раз по сравнению с известным; стабильность сохраняется достаточно длительное время. Например, в течение 4 мес активность уменьшается на 30% , тогда как известным способом иммобилизованная алкогольоксида при эксплуатации за это же время полностью теряет активность. 2 табл.

СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ АЛКОГОЛЬОКСИДАЗЫ, предусматривающий включение дрожжевой алкогольоксидазы в гелевую структуру, содержащую сывороточный альбумин, глутаровый альдегид и азид натрия в буферном растворе, перемешивание и последующее нанесение на ядерный фильтр, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и стабильности целевого продукта, в гелевую структуру дополнительно вводят комплекс меди и гистидина Cu (His) в концентрации 0,5 - 1,5 мг/мл.