Способ получения комплекса внеклеточных ферментов Советский патент 1984 года по МПК C12N9/02 C12N1/14 

1 Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способам получения ферментов, продуцируемых базидиомицетами. Известен способ культивирования базидиомицетов на питательной среде, содержащей источник углерода и минеральные соли, а также отходы производства jl . Однако данный способ не позволяе получить широкий спектр продуцируем ферментов. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предлагаемому является способ получения комплекса внеклеточных ферментов, предусматривающий культи вирование продуцентов-грибов бази- диомицетов на питательной среде, содержащей лигнинсодержащие отходы в качестве источника углерода, минеральные соли и воду с последующим отделением грибного мицелия от куль туральной жидкости, содержащего вне клеточные ферменты . К недостаткам этого способа относятся сложность технологии его. осуществления и значительные затрат времени и средств. Кроме того, спос ограничивается использованием единственного штамма дереворазрушающего гриба. В нем использован недостаточ но широкий ассортимент лигнинсодержащих отходов и получаемых при этом продуктов биосинтеза микроорганизмо в частности внеклеточных ферментов, обладающих недостаточно высокой активностью. Цель изобретения - повышение активности комплекса ферментов, а также упрощение и удешевление- способа. I.. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения комплекса внеклеточных ферментов, предусматривающему культивирование продуцентов-грибов базидиомицетов на питательной среде, содержащей лигнинсодержащие отходы в качестве источника углерода, минеральные сол и воду с последующим отделением гри ного мицелия от культуральной жидкости, содержащей внеклеточные ферменты, в качестве источника углерода использзтот агримус-отход произ водства фурфурола, содержащий целлолигнин и свободный фурфурол в 99 соотношении 42:1, в количестве 0,55,0%. Кроме того, с целью получения преимущественно фермента пероксидазы культивирование проводят путем образования поверхностной пленки при использовании агримуса в концентрации 1,0-2,5%. С целью получения преимущественно фермента монофенол-монооксигеназы, культивирование проводят путем образования поверхностной пленки при ис.пользовании агримуса в концентрации 4,0-5,0%. Агримус представляет собой многотоннажньй отход, полученный при производстве фурфурола из стержней початков кукурузы, который частично используют как лигноцеллюлозное удобрение в сельском хозяйстве. Пример 1. Готовят питательную среду следующего состава N 2,0 КН2Р040,6 К НР040,4 МрЗрф0,5 Агримус5,0 Водопроводная вода 1 л. Приготовленную таким образом среду автоклавируют, охлаждают и засевают чистыми культурами базидиомицетов Pfeurotus ostreatus (Fr.) Kumm. HMBF1300.или CorioZus versicofor (Fr.) Que2.087. Культивирование проводят в глубинных условиях на качалке в колбах Эрленмейера в течение 7 сут. при 28°С. Для сравнения в качестве контроля выращивание указанных базидиомицетов проводят также в аналогичных условиях на питательной среде, содержащей вместо агримуса целлюлозу (фильтровальную :бумагу) в количестве 15,0 г/л. В табл. 1 и 2 приведены результаты измерений активностей внеклегточных пероксидазы (КФ 1.11.1.7), монофенол-монооксигеназы (КФ 1.14. 18.1), Эндо-1,4-/3-глюканазы (КФ.3.2. 1.4), полигалактуроназы (КФ 3.1.1.15), экзополигалактуроназы (КФ 3.2.1.67) и пектинэстеразы (КФ 3.1111) в культуральных фильтратах указанных продуцентов, полученных после отделения мицелия и остатков твердого субстрата. По сравнению с контролем среда с агримусом более эффективна для получения большинства 3 ,; 10 исследуемых ферментов. Так, при выращивании PJeurotus ostreatus на среде с агримусом достигнуто увеличение активности пероксидазы .и монофенол-монооксигеназы, более чем в 12 раз по сравнению с контролем. П р и,м е р. 2. Готовят питательную среду по примеру 1, которую засевают чистыми культурами базидиомицетов Pieurotus ostreatus (Fr.) Kurara. HMBF-1300, Funalia trogii (Berk.) Bond et. Sing БИН-2 или Oxyporus obducens (Fr.) Donk.HBK-85. В отличие от примера 1 культивировав ние проводят в стационарных уелоВИЯХ методом поверхностной пленки в течение 10 сут при 28 С. Для сравнения в качестве контроля выращивание указанных базидирмицетов проводят также в аналогичных условиях на питательных средах, содержащих вместо агримуса .целлюлозу (фильтровальную бумагу) в количестве 15,0 г/л или экстракт из свекловичного жома в количестве 100 мл/л. В табл. 3 приведены результаты измерений активностей внеклеточных пероксидазы и монофенол-моноксигеназы в культуральных фильтратах указанных продуцентов, полученных после отделения -мицелия и остатков твердого субстрата. На среде с агримусом активность обоих ферментов згачитель но выше, чем в контрольном варианте. Так, для культуры Pjeurotus ostreatus активность пероксидазы на среде с агримусом составляет 18,6 ед/л. Активность внеклеточных HMBF-1300 при глубинном ферментов Fleurotus ostreatus (Fr.) Kunnn выращивании на агримусе и целлюлозе 9 тогда как в контроле с целлюлозой обнаружены следы активности этого фермента, на среде с экстрактом из свекловичного жома активность пероксидазы составляет 14,2 ед/л. П р и м е .р 3. Готовят питательную среду по примеру 1, в которую в качестве единственного источника углерода вводят агримус в количествах 5,0-50,0 г/л. Указанные среды засевают чистой культурой базидиомицета PJeurotus ostreatus (Fr.) Kumm. HMBF-1300. Культивирование проводят в стационарных условиях методом поверхностной пленки в течение 10 сут при 28°С. В табл. 4 приведены результаты измерений активностей внеклеточной пероксидазы и монофенолмонооксигеназы- в культуральных.фильтратах, полученных после отделения мицелия и остатков твердого субстрата. Из табл, 4 видно, что наибольшая активность пероксидазы культуры гриба Pleurotus ostreatus -56,2 ед/л при концентрации агримуса 1,0%, а наибольшая активность монофенол-монооксигеназы - 56,0 ед/л при концентрации агримуса в среде 4,0%. Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет повысить активность ферментов получаемого комплекса в 12 раз, а также упростить и удешевить способ за счет использования отходов производства. Та б л л. ц а

,VCnOCOB ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА ;ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ФЕРМЕНТОВ, предусматривающий культивирование продуцентовгрибов базидиомицетов на питательной среде, содержащей лигнинсодержащие отходы в качестве источника углерода, минеральные соли и воду с последуннцим отделением грибного мицелря от культуральной жидкости, содержащей внеклеточные ферменты, о т л ичающийся тем, что, с целью повьшения активности комплекса, а также упрощения и удешевления способа, в качестве источника углерода используют агримус - отход производства фурфурола, содержащий целлолигнин и свободный фурфурол в соотношении 42:1, в количестве 0,55,0%. 2.Способ по п. 1, отлича ющ и и с я тем, что, с целью получения преимущественно фермента пероксидазы, культивирование проводят путем образования поверхностной пленки при использовании агримуса в концентрации 1,0-2,5%. 3.Способ по пп. 1 и 2, о т л ичающийся тем, что, с целью (Л получения преимущественно фермента t монофенол-монооксигеназы, культивирование проводят путем образования поверхностной пленки при использовании агримуса в концентрации 4,05,0%.

ед/л

Пероксидаза Бензидин

-

Вензидин

% депоНатриеваясоль карболимеризацииксиметилцеллюлозы

1244

0,9

11,2

1285

0,7

9,0

203,5

19,9

40,5

силированный ед/мл 0,05

Продолжение табл. 1

125,0

0,04 Активность внеклеточных ферментов базидиомицетов при выращивании

методом поверхностной пленки на агримусе, целлюлозе и экстракте из жома .

Pteurotus ostreatus (Fr.) Kumra HMBF-1300 Перексидаза Бензидин ед/л 18,6 Следы

||

Funalia trogli (Berk) Bond. et. Sing БИН-2 - 14,0 Следы МонофенолмонооксигеOxyporusПероксидаза - Монофенолмонооксигеназа

Активность внеклеточных ферментов Pteurotus ostreatus (Fr) Kumm ИШР-1300 при выращивании методом поверхностной пленки в зависимости от содержания arpimyca в питательной среде

Таблица 3

14,2

18,0 Следы

13,0

г

8,0

5,0

Следы

Следы

Таблица 4 otducens (Fr.) Donk ИБК-85 14,6 Следы 10,0 Следы