Способ определения концентрации стерина Советский патент 1984 года по МПК G01N33/48 

/ff fO

(Л

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ СТЕРИНА в биологических д,0и.см объектах, включающий выделение неомыляемой фракции липидов, добавление органического растворителя, отличающийся тем, что, с целью ускорения и повышения селективности способа, в качестве органического растворителя используют гептан, формируют из липидов бесслойную .плоскую мембрану, дополнительно вводят в нее полиеновый антибиотик, измеряют стационарную проводимость мембраны и по уровню проводимости определяют концентрацию стерина.

гг

10

У/

/л

0,WЦв70.1 Щ2

;о

xo/fecfne f/ff (ftej

aoc Wffye(ft8f

pug.i Изобретение относится к биофизике и биохимии липидов и может быть использовано в медицине, в частности в исследовании липидного обмена. Известен способ определения общего содержания холестерина в биологическом материале, включающий омыление липидов спиртовым раствором щелочи, экстрагирование неомыляемой фракции липидов петролейным эфиром, промывание экстракта дистиллированной водой, упаривание растворителя и добавление реактива для осуществления цветной реакции, причем омыление липидов проводят 25-30%ным спиртовым раствором КОН в течение 12-15 ч для одновременного осуществления гидролиза биологического материалаНедостатком известного способа является длительность процесса определения и неселективность, так как в процессе омыления липидной фракции происходит также и гидролиз эфиров холестерина с образованием свободного холестерина, что мешает определению нативных стеринов. Цель изобретения - ускорение и повышение селективности способа. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения концентрации стерина в биологических объектах, включаюш.ему выделение неомыляемой фракции липидов и добавление органического растворителя, в качестве последнего используют гептан, формируют из липидов бесслойную плоскую мембрану, дополнительно вводят в нее полиеновый антибиотик, измеряют стационарную проводимость мембраны и по уровню проводимости определяют концентрацию стерина. Способ осуществляют следующим образом. Из исследуемого объекта выделяют общую фракцию липидов. Выделенные липиды (1,2 мг) растворяют в 100 мл гептана и из них формируют на отверстии тефлонового стаканчика бесслойную мембрану. В омывающий мембрану раствор (например, 100 мл КС1, рН 6,5 вводят полиеновый антибиотик в концентрации 5 -10 М и измеряют проводимость мембраны стандартными методами. По построенной ранее калибровочной кривой определяют концентрацию стерина в общих липидах. На фиг. 1 и 2 приведены графики, поясняющие предлагаемый способ. Пример 1. Для построения калибровочной кривой готовят растворы в гептане очищенных общих фосфолипидов бычьего мозга (20 мг/мл) с холестерином при соотнощении по весу холестерин фосфолипид, равном 0,04; 0,06; 0,08; 0,10; 0,12. Формируют мембраны из каждого раствора в 10 мл КС1, рН 6,5 при 22°С + 610 М нистатина. Измеряют проводимость мембраны электрометрическим усилителем. По оси абсцисс откладывают соотнощение холестерин фосфолипид, по оси ординат - удельную проводимость мембраны (фиг. 1). Исследуемая фракция - неочищенные фосфолипиды бычьего мозга. Проводимость мембраны 4 10 см. По калибровочной кривой находят соотнощение холестерин /фосфолипид 0,07. Пример 2. Калибровочная кривая для значений соотнощения холестерин/фосфолипид 0,4 - 0,9 строится аналогично (фиг. 2). Исследуемая липидная фракция - смесь фосфолипидов с холестерином с неизвестным весовым составом. По кривой находим для g 10 . см соотнощение холестерин/фосфолипид 0,8. Пример 3. С помощью указанного способа исследуют влияние на проводимость мембраны различных производных холестерина (соотнощение стерин/липид 5 20, концентрация полиенового антибиотика леворина 5-10/). Результаты представлены в таблице 1. Холестерин5-10 дхолестенон8-10 1,2--10 8-10 Д холе стеной 37-1С Капронат холестеринаб Как следует из приведенных данных, предлагаемый способ высокоселективен именно в соотнощении стерина. Способ позволяет существенно ускорить определение концентрации стерина (время определения около 1 ч). Кроме того, повыщается селективность определения, так как, например, эфиры холестерина не увеличивают проводимость мембраны. Способ может быть применен в биохимических лабораториях для экспресс-определения стерина. При этом потребное количество липидной фракции не превосходит 0,5 мг.

-2

ff,OMCflf ю io t 0,2 qf/ 0,6 0.6 1 i/e.Z xoflpcme/yf/ff M cpoc(poffaf7ff (m)