Способ определения общего содержания холестерина в биологическом материале Советский патент 1980 года по МПК G01N33/16 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕГО СОДЕРЖАНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

Изобретение относится к биологической химии, в частности к $изико-химиче КИМ способам определения общего содер жания холестерина, применяемым в научно-исследовательских и зооветеринарных лабораториях. Известен способ определения общего содержания холестерина в биолот-ическом материале, в котором для предотвращения влияния липидны.х компонентов на инте1 сивность окрашивания и точность анализов общие липиды, предварительно выделенные с помощью органических растворителей, омыляют, и цветную реакцию проводят с неомыляемой фракцией 0, раствором хлорного желе за в уксусной кислоте. Недостатком указанного способа является его трудоемкость, так как он включает предварительную экстракцию общих липидов органическими растворителями. Наиболее йшзким к предлагаемому способу является способ, при кот о рбм проводят омылёние липидов в биологическом материале с помощью спиртового раствора щелочи, экстрагирование холестерина петролейньш эфиром, промыва,ние экстракта дистиллированной водой, упари ван:ие растворйтеляи цветную реакцию с хлорным железом и уксусной кислотой. ГЖ1естаыГс оГоёеспечива6т бпрёделение оёщего содержания холестерина в таком биоло: йческом материале, как сйЫрШГа йрТЗЁИ, плазма, но он не применим1гля тканей животных. Недсктатком его является такжэ сравнительно низка я ч твствител ьность цветной реакции хопестеринй с хлор1ным же лезом. Цель изобрет-эния - повышение чувствительности способа при определении холестерина в тканях животных. Цель достигается том, что омыление ли11идов провойят 25-.30%-ным спиртовым р&створом КОП в гечоиио 12-15 ч aria осуществления одновременно и гид ролиза биологического материала, экстр гируют неомьшяемую фракцию линидов петролейным эфиром, промывают экстрак дистиллированной водой, упаривают раст веритель и добавляют сульфофосфованили новый реагент для осуществления цвет ной реакции. Пример. Среднюю пробу и тканей животных в количестве 0,2,- 0,3 г помещают в пробирку с 2 мл 25«-30%.-ного раствора КОН в воде с метанолом (1:1) и проводят одно- временный гидролиз биологического ма териала в течение ч при в термостате. Объем содержимого пробир ки доводят дистиллированной водой до 5 мл, прибавляют 4 мл петролейного эфира, энергично встряхивают и после разделения фаз верхний слой отсасывают в другую пробирку. Затем дважды проводят экстрагирование 3 мл петролейного эфира. Объединенные экстракты сначала промь{6ают 6 мл 1н раствора КОН, а потом 2 раза 6 мл дистиллированной во ды и 0,1 объема экстракта упаривают в вакуумном шкафу при 40 Б-С или на водяной бане при температуре С. К сухому остатку добавляют 1 м ккмкчески чистой концентрированной серной кислоты, выдерживают 1О мин в кипящей водяной бане или 20 мин при 105 С в термостате. В охлажден

25 50 100 15О 200 25О 400

- 1

О

. 1 + 5 .94 ную пробирку приливают 2 мл фосфованил шсвого р.еактива, состоящего иа 1 части 0,й%«-ного водного раствора ванилина и 4 частей ортофосфорной кислоты, энер. гично встряхивают, выдерживают в течение 45 мин при комнатной температуре для развития стабильного малинового окрашивания в течение 24 ч и колориметрируют при длине волны 56О мм в кю«вете с толщиной слоя 5 мм против сле пой пробы с 1 мл концентрированной серной кислоты и 2 мл фосфованилиново- го реактива. Положительный эффект предлагаемого способа по сравнению с известными сос тоит в том, что достигается стабильное цветное окрашивание в течение 24 ч, высокая чувствительность и, кроме Toino, повышается производительность на 10- 20%, .Наряду с этим, исключив предварительное экстрагирование общих липидов, на 1 анализ экономится 25 мл смеси диэтилового эфира и этанола в объемном соотношении 3:1 или 50 мл смеси хло реформа и метанола в объемном соотношении 2:1, Кроме этого все анализы можно проводить в мерных пробирках без испсшьзования мерных колб и делительных воронок, Сравнение предлагаемого способа с известным способом определения общего содержания холестерина приведено в таблице.,

Формула изобретения Способ определения общего содержания холестерина в биологическом материале, включающий омыление липидов спиртовым раствором щелочи, экстраги рование неомыляемой фракции липидов петролейным эфиром, промывание экст ракта дистиллированной водой, упари вание растворителя и добавление реакти для осуществления цветной реакции.

7373SS

о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повыщения чувствительности способа при определении холестерина в тканях животных, омыление лйпндов проводят

25-30%-.ным спиртовым раствором КОН в течение 12-15 ч для осуществлении одноврёмённб и гидролиза би(У1бг1гчес материала причем в качестве еактнва ДЛЯ цветной реакции используют бульфофосфованилиновый реагент.

Hs -4hj-/-i.bi,,.