Способ получения антигена для серологической диагностики сальмонеллеза Советский патент 1984 года по МПК C12N1/04 

сх 4 to

со со 1 И-лобретенно относится к иммунохимии, преимущественно к получению биологических диагностических препаратов, и может быть использовано для серологической диагностики сальмонеллезов группы В. Известные способы получения антигена для диагностики сальмонеллеза не позволяет получить препарат с необходимой антигенной специфичностью И Известен способ получения антигена для серологической диагностики сальмонеллеза путем выделения липополисахарида из биомассы сальмонелл с помощью водно-фенольной экстракции 90%-ным раствором фенола 21. Однако полученные таким образом липополисахаридные антигенные препараты проявляют 8 серологических реакциях недостаточно выраженную специфичность, поскольку не удается получить моноантигены группы В, Целью изобретения является повышение специфичности диагностики сальмонеллеза группыв. Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения антигена для серологической диагностики сальмонеллеза путем вццеления липоцолисахарида из биомассы сальмонелл с помощью водно-фенольНо экстракции 90%-ным раствором фенола после водно-фенольной экстракции дополнительно смейивают 0,5-1,0%-ны раствор.липополисахарида в нейтраль ном забуферённом физрастворе с равным объемом О,0005-0;00015 М раство ра периодата калия, вьщерживают в течение 1 ч, нейтрализуют действие периодата: калия добавлением 2%-ного раствора глюкозы. П р им ер. Культуру сальмоиелл выращивают в чeтвeptяx с 2,5%-нь1м агаром (МПА) 18 ч. Бактерийную масс с каждой четверти смывают 10 мл физиологического раствора. Чистоту культуры контролируют бактериоскопи ческИм исследованием. Бактерийную массу дважды отмываю1Т физиологическим раствором при 5000 об/мин, переносят в колбу и запивают при перемешивании 400 мл (на 2 г клеток влажный вес) воды, предварительно нагретой на водяной бане до 65-68 с Суспензию интенсивно перемешивают, прибавляют 400 мл 90%-ного фенола (65-68®С) и смесь выдерживают 20aS25 мин при 68. Обра:п)1к ншу1ося эмульсию охлаждают сначсига при комнатной температуре до , а затем 1-2 ч в холодильнике до 4-5°С. После этого смесь центрифугируют 30 мин (1000 об/мин), смесь разделяется на три слоя: верхний - водный, содержащий липополисахарид и нуклеиновые кислоты, промежуточный - фенольный, содержащий белок, и нижний, содержащий остатки разрушенных клетрк и крупномолекулярный белок. Водньй слой отделяют с помощью сифона И диализуйт 48 ч против проточной воды (), далее лиофилизируют. Для разруш ения 0,12 антигена в липополисахариде готовят 5 мл 0,5-1%-ного раствора липополисахарида в КаС2-буфере, рН 7,1, сливают в равных объемах раствор липополисахарида и 0,00015 М раствор периодата калия в NaCi-буфере, выдерживают 1 ч, добавляют несколько (5) капель 2%-ного раствора глюкозы. Через 10 мин раствор антигена используют для посадки на эритроциты в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА). В табл. 1 приведены сравнительные результаты РИГА с липополисахаридами (ЛПС) до и после обработки раствором периодата калия. В табл. 1 приведены сравнительные результаты, постановки РИГА с липопо- лисахаридами из S.essen и S.upsala до и после удаления антигена 012 и с сыворотками к сальмонеллам с различным набором антигенов. Предлагаемый способ обеспечивает возможность полного разрушения антигена 012, что подтверждается отрицательными peзyльтaтa lи РИГА с липополисахаридами без антигена при наличии высоких титров реакции с липополисахаридом, полученным известньм способом. Обработка ЛПС раствором периодата калия не влияет на антиген 04; при постановке РИГА с сыворотками к S.paratyphi В, S.essen и S.upsala не отмечено разницы в титрах до и после обработки раствором периодата калия. Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить специфичность липополисахаридного антигена сальмонелл группы В. Предлагаемый способ обеспечивает возможность полного ргтчрушения антигена 012 при coxpaHiMimi aiiTHreEia 04, специфичного для i-pynпы В сальмонелл. В табл. 2 приведены средние геометрические титры у обследованны групп. Иэ табл. 2 видно, что активность диагностикума 0-4 не уётупает актив кости диагностикума 0-1, 4,12 (коммерческий диагностикум, Москва, НИИЭМ им.Г.Н.Габричевского), о чем свидетельствуют примерно равные титры РИГА с указанными препаратами полученные у больных сальмонеллезам группы В. Значительно более низкие титры РИГА с диагностикумом 0-4 по сравнению с коммерческим диагностикумом 0-1, 4,12, полученные при обследовании доноров, свидетельству о более высокой специфичности диагностикума 0-4. Постановка РИГА с диагностикумом 0-4, специфичным для группы В сальотрицательной пробы говорить об отсутствии антител к сальмонеллам группы В. В силу высокой специфичности диагностикума он может применяться в сомнительн 1х случаях для дополнительной диагностики сальмонеллов группы В. Это позволяет повысить эффективность серологического типирования группы В сальмонелл, что в свою очередь повышает эффективность лабораторной диагностики заболеваний. Способ разработан и внедрен в лаборатории специфической индикации возбудителей инфекционных заболеваний Горьковского НИИ эпидемиологии и микробилогии. В настоящее время этиологическим фактором подавляющего числа сальмонеллезов на территории СССР являются сальмонеллы группы В. При постановке серологического диагноза у больных сальмонеллезами обычно используется набор сальмонеллезнык диагностикумов к группам А, В, С, D и др. За счет общих антигенов наблюдаются выраженные перекрестные реакции у групп А, В и D что не всегда позволяет правильно оценить реакцию и, следовательно поставить диагноз, особенно, если нет бактериологического подтверждения. Таблица 1

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА для серологической диагностики сальмонеллеза путем выделения липолисахарида из биомассы сальмонелл с помощью водно-фенольной экстракции 90%-Ным раствором фенола, отличающийся тем, что, с целью повьппения специфичности диагностики сальмонеллеза группы В, после йодно-фенольной экстракции дополнительно смешивают 0,5-1,0%-ньй ,, раствор липополисахарйда в нейтральном забуференном физрастворе с равным объемом 0,,00t)15 М раствора периодата калия, вьщерживают в течение 1 ч, нейтрализуют действие периодата калия добавлением 2%-ного раствора глюкозы.

Использовали сухие неадсорбированные водства Ташкентского НИИВС. агглютинирующие сыворотки произБольные паратифом В

и прочими сальмонеллезами группы В104

Доноры101

Таблица 2

1:208

1:260 1:24 1:4