СП Изобретение относится к микробио логической промышленности и касается получения биомассы микроорганизм . обладающих бактериостатической акти ностью. Цель изобретения - создание способа получения биомассы микрооргани мов типа Beggiatoa, обладающей бактериостатической активностью. Указанная цель достигается тем, что в способе получения биомассы микроорганизмов типа Beggiatoa, обладающей бактериостатической активностью, клетки микроорганизмов штам ма Beggiatoa NCIB 11418, NCIB 11419 NCIB 11420, NCIB 11421, NCIB 11422, NCIB 1Г423, NCIB 11424 или NCIB 1J42 гомогенизируют, гомогенат культивируют в аэробных условиях при 16-24 ч при рН 6,6 в жидкой питательной среде и отбирают биомассу и/или культуральную жидкость, Микроорганиз типа Beggiatoa получают предпочтительно из барежин Для вьщеления штамма помещают образец барежина на агар-агаровую питательную среду, вьщерживают 6-16 ч при 5-50Рс, отделяют участок со сво бодными от загрязнений нитями микроорганизма типа Beggiatoa, помещаю этот участок на ту же питательную среду инкубируют, отделяют и пересаживают 2-3 раза, Вьзделено восемь штаммов, депонированных в Национальной коллекции пpo шшпeнныx бактерий (NCIB) в Абер дине, Шотландия, под номерами NCIB 11418-11425. Агар-агаровая питательная среда содержит 1-4 г экстракта дрожжей и 10-20 г агара на 1 л воды. Способ осуществляется следующим образом. Культуру микроорганизма типа Beggiatoa гомогенизируют и культивируют в жидкой питательной среде, содержащей 1-4 г экстракта дрожжей 0,1-0,3 г хлористого кальция и 0,21 г ацетата натрия или аммония на 1 л воды. Для предохранения культуры в процессе культивирования в среду . можно добавить 5-20 МЕ/мг каталазы. Культивирование ведут при t 5-36 ч при рН 6-8. Предпочтительно культивирование проводят в течение 8-10 ч при 30-40 С и нейтральном рН. Полученный целевой продукт можно лиофилизировать. 1. Зьщеление штаммов, Пример , взятого из НациоХлопья свежего нальной водолечебницы Эй-ле-Беин, барежина помещают в центр чашки Петри, содержащей среду, приготовленную по рецепту: Экстракт дрожжей (Дифко), г2 Агар (Бакто-Дифко) , г Отфильтрованная термальная вода, Дистиллированная вода, мл 4aiilKy Петри помещают на 30 ч в сушильный шкаф при . Потом содержимое изучают под микроскопом при слабом увеличении, чтобы обнаружить присутствие характерной спиралевидной структуры Beggiatoa, проявляющееся по скользящей подвижное ти этих микроорганизмов, некоторые из которых видны невооруженным глазом. Микроскопический анализ обнаруживает также участки с кажущимися свободными от загрязнения нитями Beggiatoa. Один из таких участков вырезают стерильным скальпелем и наносят на чистую пластинку агара такого же состава, как в первом случае. При этом поверхность с нитями Beggiatoa кладут на чистую поверхность новой пластинки агара. Инкубацию вновь продолжают 24 ч при 30°С. Операцию вырезания, пересадки и инкубации повторяют еще два раза. В результате получают чистую культуру Beggiatoa, Пример 2. Консервация штаммов. Описанным в примере 1 образом вьщеляют восемь штаммов. Они отличаются друг от друга диаметром нитей, скоростью их скольжения и формой образовавЩихся на агаре колоний. Они успешно консервируются тремя paзличны ш методами: кратковременным, средней длительности и длительным. 2.1,Метод кратковременной консервации. Пластинку хранят в холодильнике при 4°С, герметизируя чашку Петри. Штамм перемещают каждые десять дней, ибо, агар склонен к высыханию, 2.2.Консервация средней длительности. Готовят полужидкую среду следующего состава: Экстракт дрожжей, г2 Хлористый кальций, г О 1 Ацетат натрия, г Агар, г Отфильтрованная термальная вода, После стерилизации в среду добав ляют грибковую каталазу в количеств 10 международных единиЦ/л. Раствор каталазы предварительно стерилизуют в холодном состоянии на миллипорист фильтре К размером икpocкoпичecкиx пор 0,22 мкм. Небольшой кубик, агара содержащи Beggiatoa, помещают в трубку с 10 м среды. Инкубацию ведут при 30 С. Beggiatoa развивается в верхней части трубки. Tpy6j y можно держать три недели при 30 С. Потому культур перемещают из расчета 0,1 мл на трубку. 2.3. Метод длительного хранения. Готовят в течение 24 ч культуру в перемешиваемой среде так, как описа но в примере 1. Потом центрифугирую Осадок промывают стерильным раствором Рингера, выморсшивают и лиофили зируют. Состав может храниться несколько месяцев в холодильнике в хорошо закрытом сосуде. После регидратации фрагменты нитей способны к развитию. Пример 3. Культивирование штаммов. 3.1. Прививка. Вырезают небольшо кубик агара с 5 мм размером грани из пластинки, полученной так, как было описано в примере 1. Один куби помещают в 500 мл колбу, содержащую 100 мл следующей среды: Экстракт дрожжей, г4 Хлористый кальций , г0,2 Ацетат аммония, т1 От4«льтрованная термальная вода, мл1000 Эта среда имеет рН 6,6. Колбу помещают на орбитальную мешгшку, вращающуюся со скоростью 150 об/мин при радиусе вращения 1,25 см. Здесь колба остается в течение 16 ч при температуре .. Полученную культуру гомогенизируют с помощью мещалки в течение 1530 мин в стерильных условиях. Гомогенизированная культура будет слу«ить прививкой. 3.2.Культивирование. 5 мл описанной выше прививки помещают в 500 МП колбу, содержащую 100 мл той же среды, которая была использована для получения прививки. Колбу подвергают инкубации в течение 24 ч при на орбитальной мешалке. Получают 0,8 г сухого вещества Beggiatoa на 1 л культуры. Повторяя операцию с различными штаммами № 11418-11425 и, варьируя условия в дoпycти lыx пределах, получают выходы, колеблющиеся от 0,5 до 2 г Beggiatoa в сухом виде на 1 л культуры. 3.3.Регулирование роста. Каждые 2 ч берут образец культуры и гомогенизируют их с помощью мешалки. На спектрофотометре определяют оптическую плотность при 600 нм. Гомогенизированный образец осаждается очень медленно и это обеспечивает надежное считывание результатов. Таким образом подтверждается прямая зависимость роста от числа клеток. 3.4.Определение сухого веса. Классический метод сушки в печи не дает результатов, вследствие высокого содержания воды. Поэтому приходится сушить не менее 400 мл культуры путем лиофилизации. 3.5.Определение бактериостатической активности. Beggiatoa является строго азробным микроорганизмом, и концентрагщя кислорода в опытных трубках для него недостаточна. Опыт проводят в колбах, размешивая, повышая этим снабжение кислородом. Готовят три серии колбочек емкостью 50 мл, содержащих каждая по 18 мл питательного бульона. Колбы первой и второй серий инокулируют каждую с 4 мл 24-часовой культурой патогенного штамма. Используют три патогенных штамма: Pseudomonas aeruginosa АТСС 10145, Esehericfiia coli АТС 11755 и Staphylococcus aureus АТСС 12600 Образцы бактериостатического продукта готовят, центрифугируя культуру, полученную согласно примеру 3-п, 2, но в течение 8 ч. Центрифугированную биомассу гомогенизируют и переводят в суспензию в объеме физиологического раствора, равного объему всплывающего при центр«фугировании раствора. Физиологический раствор, содержащий биомассу и всплывающий материал, делят каждый на образцы в 2 мл.
В колбы 1-ii серии добавляют 2 мл физиологического раствора, содержащего гомогенизированную биомассу. В колбы 2-н серии добавляют по 2 мл одного только физиологического раствора.
В колбы 2-й серии, не инокулированные патогенным материалом, добавляют 2 мл физиологического раствора, содержащего гомогенизированную биомассу.
Колбы инкубщ)уют при 37°С на орбитальной мешалже и измеряют оптическую плотность при 600 им спустя 16 ч. В результате измерения оптичес 15 КОЙ ПЛОТНОСТИ: соответствующих колбо чек серии 1,2 я 3 огар-ед-еляют соответствующие параметры А, В и С. Раз ность А-С, вычтенная из В, потом разделенная на В и умноженная на 10 определяет бактериостатическую акти ность биомассы в процентах ингибирования. Таким же образом определяют бакт риостатическую активность всплывающего материала, причем в колбочки первой и третьей серий, сод ержащие биомассу, вмест о 2 ип физиологическ го раствора добавляют 2 мл всплывше го гомогенизированного материала. Полученные результаты сведены в табл. 1. Пример 4 (сравнительный). Для сравнения, методом описанным в примере 3, п. 5 определяют бактерио статическую активность натурального барежина. % ингибирования составил спустя 16 ч инкубации для P.aeruginosa, S.aureus и E.coli соответственно 100, 83 и 96. Иными словами, бактериостатическая активность биомассы по данному изобретению оказалась почти такой же сильной, как у барежина. Пример 5 (штаммы NCIB 1141 11425). Штаммы были вьщелены так, как это описано в примере 1. В табл. 2 указана оптическая плотность этих штаммов, полученная спустя 5, 10 и 24 ч после культивирования каждого штамма в условиях, описанных в примере 3, п. 2 и бактериостатическая активность получен ной биомассы по отношению к трем ггатогснным штаммам P.aeruginosa, S.aureus и r.ccli. Морф|.хпогия. Штамм NCIB 1КИ8. На агаре: образует кпуггмые изолированные колонии, диаметром 8-15 мм с белым цент ром и прозрачными краями, при рассмотрении в микроскопе (х 100): - колония образована хороню видимыми спиралями, окруженными уплотненным материалом-, в жидкой культуре: однородная культура, при рассмотрении в микроскопе (х 100): длинные нити 80 1,8 мкм, иногда образованные короткими хорошо заметн1 1М11 бациллами агрегация отсутствует , очень мало преломля10гщ1х включений.
Штамм NCI.B 11419. На агаре: образует изолированные белые колонии диаметром 4-8 мм с размытыми краями; радиально, знездообразно распространяются толстые нити, идущие от, центра колонии, но не достигаю1цие краев: при рассмотрении в микроскопе (х 100) края колонии образованы сжатыми спиралевидными нитями: в жидкой культуре: гомогенная культура, при рассмотрении в микроскопе (х 100): изолированные, очень короткие нити 3,6 -0,9 мкм, разделенные очень четко сужениями; преломляющих включений нет, наблюдаются агрегаты. Штамм NCTB11420. На агаре: образует плоские, изолированные непрозрачные колонии диаметром 2-5 мм с фестонными краями при рассмотрении в микроскопе (х 100): колонии образованы из фрагментов нитей, образующих плохоразвитые спирали, в жидкой культуре: однородная- культура, при рассмотрении в микроскопе (х 400):.нити отсутствуют длинные бациллы 9-1,4 мкм с небольшим количеством, преломляющих включений. Штамм NCIB 11421. На агаре: образует отдельные колонии диаметром 4-7 мм с размытыми краями, подобные колониям, образуемым штаммом NCIB 11419, но более белые, края колоний прозрачные: при рассмотрении в ьдакроскопе (х 100): нет видимых спиралей в жидкой культуре: гомогенная культура, при рассмотрении в микроскопе (х 400): картина близкая к наблюдаемой для штамма 1l420i нити отсутствуют: длинные бациллы 18- 1,4 мкм, содержащие некоторое количество преломляющих включений. Агрегаты отсутствуют. Штамм NCIB 11422. На агаре: никогда не образуется изолированных колонийJ покрыв.1ет всю поперхрюсть прозрачными мокоиднымм нитями при рассмотрении и мтгкроскопс(х 100): нити образованные многими фнламентами в жидкой культуре; . однородная культура представляет собой на шестом часу несколько маленьких агрегатов, при рассмотрении в микроскопе (х 400): длинные раздельные нити размером от 90 . 1,4 до 1,4 -1,8 мкм, нити разделены на длинные единицы четко видными сужениямиf очень мало преломляющих включений. Штамм NCIB 11423. На агаре: напоминает штамм NCIB 11422; изолиро ванных колоний нет, видны плотные микоидные нити; при рассмотрении в микроскопе (х 100): нити более четко определены, поскольку они образованы из большего числа филаментов; в жидкой культуре: имеет форму крупных хлопьев (агрегатов), при рассмотрении в микроскопе (х 400): филаменты значительно более короткие, чем у штамма 11422 и разделены четко выраженными суже ниями на сегменты, длина 9-10 18 м очень быстро, спустя 5ч, появляют ся преломляющие включения. Штамм NCIB 11424. На агаре: напоминает штамм NCIB 11423, изолированные колонии отсутствуют: микоидные нити при рассмотрении в микроскопе (х 100): нити, образова ные большим количеством филаментов в жидкой культуре: образуются круп ные хлопья (агрегаты)} при рассмот рении в микроскопе (х 400): длинны филаменты 140 1,8 мк, образующие длинные, пучки; видимые сужения отсутствуют: запоздалое развитие
Таблица 2 (спустя 10 ч) преломляющих включений. Штамм 11425. На агаре: образует непрозрачные изолированные колонии размером 2-6 мм в диаметре, при рассмотрений в микроскопе (х 100): колонии, образованные из изолированных клеток, создающих сжатые спирали: в жидкой культуре: однородная культура- при рассмотрении в микроскопе (х 400): однородные короткие филаменты 4 1,4 мк, мало преломЛЯНИЩ1Х включений. Использование изобретения позволяет получать биомассу в промышленном масштабе, тогда как барежина в естественных условиях Лолучается очень медленно и в малых количествах, что не позволяет удовлетворить потребности медицины и косметической промьшшенности. Таблица 1 Ингибирование патогенных микроорганизмовАктивность (% ингибиПатогенныйрования) агент биомассы всплывшего материала P.aerugino-7041 S.aureus10045 E.coli7011
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ ТИПА BEGGIATOA, ОБЛАДАЮЩЕЙ БАКТЕРИОСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ, заключающийся в том, что клетки ьшкроорганизмов штамма Beggiatoa NCIB 114-18, NCIB 114t9, NCIB 11420, NCIB 11421, NCIB 11422, NCIB 11423, NCIB 11424 или NCIB 11425 гомогенизируют, гомогенат культивируют в аэробньк условиях при З0с 16-24 ч при рН 6,6 в жидкой питательной среде и отбирают биомассу и/или культуральную жидкость.
0,91 0,95 0,95 0,95 0,75
1090263
114230,360 0,496 0,378
114240,217 0,737 0,587
114250,395 0,981 0,838
10 Продолжение табл, 2
73 87 25
57 80 27
100 91 90
