Способ получения белка Советский патент 1978 года по МПК C12D13/06 

1

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано для получения внутриклеточных веществ микробиологического происхождения: белков, ферментов, нуклеиновых кислот или пигментов.

Известен способ получения белка, предусматривающий культивирование микроорганизмов на питательной среде в присутствии антибиотика с последуюп1им выделением белка 1.

Однако по известному способу в питательную среду, содержащую микроорганизмы, добавляют антибиотик с повышенной концентрацией, что вызывает нарущение кинетики роста микроорганизмов.

Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта.

Для достижения поставленной цели перед введением антибиотика в ку.льтуральную среду определяют его концентрацию в культуральной среде, нри которой приостанавливается рост микроорганизмов, а затем в питательную среду вносят антибиотик в количестве 5% от этой концентрации.

Способ заключается в следующе.м.

Питательная среда для выращивания микроорганизмов содержит вещества, необходимые для размножения клеток этих микроорганизмов, т. е. источники углерода и азота, например, углеводы и/или углеводороды, азотсодержащие вещества, минеральные соли. Она может содержать стимуляторы роста, например витамины, а также кислород, если микроорганизм живет и размножается в аэробных условиях.

Микроорганизмы выращивают в ферментере, заполненном питательной средой, в условиях аэрации кислородом при температуре 20-50°С и рН 3,0-8,0. В питательную среду, желательно в показательной фазе роста .микроорганизмов, добавляют антибиотик или смесь нескольких антибиотиков в таком количестве, чтобы рост не приостанавливался и чтобы протеины, содержащиеся в клетках, не выходили в питательную среду.

Согласно способу опреде.тяют ряд концентраций, соответствующих системе «микроорганизм- антибиотик. Верхний предел этого ряда может быть определен для рассматриваемой системы путем измерения концентрации антибиотика питательной среды, начиная от которой рост микроорганизма останавливается. Остановка роста происходит обычно некоторое время после добавления антибиотика в питательную среду. Для бактерии Sarcina lutea

концентрации антибиотика в питательной ереде, при которых происходит остановка роста, составляют 0,05 международной единицы (ME) для пенициллина G, 100 мг/мл для Д-циклосерина и 30 мг/мл - для бактитрацина. Нижний предел этого ряда концентраций составляет как правило 5% значения верхнего предела ряда. Это означает, что при более низких концентрациях ослабление клеточных перегородок становится незначительным и не оказывает существенного влияния на эффективность деления клеток в ходе последующего процесса разрыва.

Концентрацию антибиотиков в питательной среде для рассматриваемой системы выбирают между двумя крайними значениями в зависимости от требований, предъявляемых к способу. Концентрация антибиотиков, выбранная в верхнем пределе, вызывает некоторое уменьшение степени роста микроорганизма, сопровождающееся большим увеличением числа раздробленных клеток для данного уровня энергии дробления (например для какого-то рабочего давления гомогенизатора). Если изменение кинетики роста нежелательно, целесообразнее применять более слабые концентрации антибиотиков, что предполагает использование более мощной энергии дробления (по сравнению с предыдущим случаем) для получения той же эффективности дробления.

Культуру микроорганизмов выдерживают в ферментере в течение нескольких часов, затем биомассу отделяют от питательной среды, например центрифугированием, декантированием или фильтрацией, клетки промывают и переводят в водную суспензию. Суспензию подвергают механической обработке гомогенизатором или соответствующей мельницей, вызывающих разрыв клеточных перегородок.

Пример 1. Бактерии Sarcina tea выращивают в 1,5 л стерилизованной водной нитательной среды, рН 6,5 которой устанавливают до стерилизации. Состав этой среды следующий,°/о;

NH4Ce0,100

М§5Од-7НгО0,050

К2НРО40,100

Ре5О4-7НгО0,001

CaCej1,010

Пептон1,000

Дрожжевой экстракт0,500

Сахароза0,500

ВодаДо 100Выращивание продолжают 24 ч при 25°С в аэробных условиях в колбе, взбалтываемой путем вращения. Затем полученную культуру В8ОДЯТ в 9 л водной питательной среды, находящейся в 14-литровом ферментере. Эта питательная среда имеет тот же состав, что и вышеописанная, но содержит 1% дрожжевого экстракта и 2% сахарозы.

Бактерии выращивают в ферментере при 25°С, перемешивая питательную среду мещалкой, вращающейся со скоростью 250 об/мин; вентиляция обеспечивается путем подачи 7 л воздуха в минуту прИ атмосферном давлении.

В показательной фазе роста в питательную среду добавляют пенициллин G с таким расчетом, чтобы получить концентрацию пенициллина, равную 0,04 Международной единицы (ME) на I мл питательного бульона. Культуру бактерий выдерживают 9 ч, а затем отделяют бактерийные клетки от питательной среды путем центрифугирования.

Полученные клетки про.мывают и помещают во взвешенном состоянии в воду из расчета 30 г сухого вещества на 1 л воды. Затем водную суспензию обрабатывают .механическим путем в дробильной установке R1B1 при давлеНИИ 700-1000 атм.

Количество разорванных клеток, определенное путем дозирования освобождающегося азота, составляет 20°/о от общего числа клеток. Аналогичная механическая обработка, проведенная с клетками Sarcina uiea, выращенными при тех же условиях, но при отсутствии антибиотиков, вызывает разрыв только 4% клеток.

в то же время добавление 0,04 ME пенициллина G на 1 мл питательной среды увеличивает лищь на 10% время димеризации микроорганизма, т. е. оказывает очень незначительное влияние на кинетику воспроизводства микроорганизма.

Пример 2. Бактерии Bacillus megaterium выращивают в 0,5 л питательной водной среды, рН которой устанавливают 6,5 до стерилизации. Состав среды, %:

(NH4)2HPO41,000

К2НР040,500

-.NaaSOi0,500

MgS04-7H200,400

FeSO4-7H2O0,002

NaCe0,002

Дрожжевой экстракт0,025

Жидкость мацерации кукурузы0,025

Сахароза2,000

Вода.До 100,

Выращивание продолжают 24 ч при 30°С в аэробных условиях и при помешивании путем встряхивания. Затем 5% полученной культуры вводят в 9 л водной питательной среды, находящейся в 14-литровом ферментере и имеющей тот же химический состав, что и инкубационная среда. Бактерии выращивают при 30°С, пере.мещивании со скоростью 250 об/мин, расходе воздуха 7 л в 1 мин, при атмосферном давлении. В показательной фазе роста в питательную среду добавляют 4 мг/мл бактитрацина. После 9 ч роста в этих условиях бактерийные клетки отделяют от питательной среды путем центрифугирования.

Собранные, промытые и помещенные в водную суспензию клетки подвергают механической обработке аналогично примеру 1.

Количество разорванных клеток, определенных по способу, описанному в примере 1, составляют 61% от общего, числа клеток. Аналогичная механическая обработка клеток Bacillus megaterium, выращенных в тех же условиях, но без добавки антибиотиков, вызывает разрыв 26% клеток.