Способ получения цеаксантина Советский патент 1977 года по МПК C12D5/00 A23K1/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕАКСАНТИНА

Изобретение относится к способам получения цеаксантина путем микробиологического синтеза.

Желтый пигмент, называемый цеаксантином или 3,3-р-диоксикаротином, может быть использован в качестве кормовой добавки для кур для усиления желтой окраски их кожи или желтка яиц. Изучается возможность использования этого вещества в качестве красителя в косметической и пищевой промышленности.

Известен способ получения цеаксантина, включающий культивирование его продуцентов микроорганизмов из рода Flavobacter на жидкой питательной среде, содержащей источники усвояемого углерода, свободные аминокислоты, минеральные соли, микроэлементы и витамины 1.

Однако процесс получения этих пигментов путем биосинтеза микроорганизмами является сложным, зачастую характеризуется очень низким выходом при значительном расходе питательной среды.

Для повыщения выхода цеаксантина по предлагаемому способу в питательную среду перед культивированием микроорганизмов дополнительно вводят свободные серусодержащие аминокислоты, например цистин, цистеин или метионин, до величины не более 1 мг/мг среды, и микроэлементы в виде ионов двухвалентных металлов Fe+, Со++, , Мп++ в концентрации, равной 0,001-0,1 м.

Предлагаемый способ позволяет значительно повысить выход цеаксантина, в отдельных случаях - в четыре раза по сравнению с известным, благодаря чему снижаются издержки производства.

Для осуществлешш предлагаемого способа сначала готовят питательную среду, в которой в качестве источника ассимилируемого углерода используют 0,1 -15% глюкозы или сахарозы от веса культуральной среды, в качестве ассимилируемого аминного азота - 0,1-8% от веса среды дрожжевого или кукурузного .экстракта или же гидролизата белков отвеса среды. В среду вводят также 0,1- 2% сульфата магния. Эти вещества разводят водопроводной водой до 100 вес. %.

Состав аминокислот в среде изменяют добавлением метионина, цистина или цистеина, доводя их содержание предпочтительно до 3-10% относительио количества других аминокислот.

Затем в приготовленный таким образом иитательиый раствор добавляют инокулюм микроорганизмов из рода Flavobacter. Процесс

ферментации осуществляют при постоянном неремешивании и аэрации при соответствующем значепии рН, температуре и времени, необходим для но.тучения значительного количества внутриклеточного цеаксантина.

Затем питательную среду высущивают, в случае необходимости после концентрирования экстрагируют клеточный цеаксантин с помощью полярного органического растворителя, такого как ацетон, этиловый снирт, или хлористого растворителя, например хлороформа. Затем отделяют биомассу от культуральной среды путем центрифугирования, декантации нли фильтрации. Биомассу можно использовать, HanpH-viep в качестве кормовой добавкн для кур, или же ее экстрагируют нолярным органическим растворителем.

Концентрация цеаксантина в биомассе при получении его таким образом возрастает примерно до 50% по сравнению с концентрацией в культуре такого же микроорганизма, получаемого на классической среде. Увеличение выхода цеаксантина не является следствием увелнчения абсолютного количества метионина и/или цистина, и/или цистеина в основном питательном растворе, а это - сравнительное колнчество по отношению к количеству аминокислот, имеющихся в основном питательном растворе или питательной среде.

Однако количество метиопина и/или цистина и/или цистенна, добавляемого в среду, ограннчивают до величины не более 1 мг/мл, так как большие количестг.а обладают ингибирующим действием.

Такое же действие отмечается при добавлении в основной питательный раствор микроэлементов, например в виде ионов двухвалентных металлов , Со++, Мо++, Мп++, без добавления указанных серусодержащнх амннокислот, что приводит к увеличению концентрацнн цеаксантина в биомассе до 50% и одиовременно к увеличению биомассы также до 50%, то есть производство цеаксантина возрастает вдвое но сравнению с известным способом культивирования микроорганизма на классической питательной среде.

Состав микроэлементов среды изменяют введением ионов таких двухвалентных металлов, как Fe+-, Co+ Мо++, Мп--+, вводят их в ограниченных количествах, не превышающих 0,1 М, во избежание проявления явления ингибирования. Ионы указанных металлов вводят в количестве 0,0005-0,1 М. Оптимальное их количество 0,001-0,05 М. Ионы металлов вводят в виде таких хорощо растворимых солей, как, например, сульфат железа или хлористое железо, хлористый кобальт, молибдат натрия н сульфат магния. Предночтительной аминокислотой для среды является метионин и предпочтительным ионом металла является нон Fe++.

При одновременном введении приведенных выше серусодержащих аминокислот и указанных ионов металлов наблюдается явление синергизма, благодаря чему продукция цеаксантина может быть увеличена в четыре раза по сравнению с известным способом культивирования этого микроорганизма на классическом питательном растворе. Увеличение производства цеаксантина происходит вследствие увеличения в три раза концентрации цеаксантина в биомассе но сравнению с увеличением количества самой биомассы. Пример 1. Готовят культуральную среду,

следующего состава; вес. %:

Глюкоза3

Гидролизат казеина (тринтон)1

Дрожжевой экстракт1

Сульфат магния0,5

Вода водопроводнаяДо 100.

Среду помещают во флакон, стерилизуют при 120°С в течение 20 мин, затем охлаждают до 25°С, рН среды носле стерилизации устанавливают 7,3. В среду вводят инокулюм

мутанта штамма АТСС ЛЬ 21588 из рода Flavobacter. Культура этого микроорганизма выдерживается на указанной среде в течение 48 ч при температуре 25°С, среда постоянно аэрируется поворачиванием флаконов на соотзетствующих аппаратах. После окончания процесса культивирования флаконы центрифугируют и собирают клеточную массу, которая составляет 10,5 г искомого вещества на 1 л питательной среды.

Количество цеаксантина, содерл ;ащегося в клетках, определяют экстракцией пигмента и носледующим измерением оптической плотности экстракта. Для получения экстракта приготовляют суспензию клеток в 5 мл водного

солевого раствора, затем добавляют равный объем ацетона, встряхивают несколько минут и фильтруют. Оптическую плотность фильтрата определяют на спектрофотометре при длине волны 450 нм. Количество цеаксантина

определяют сравнением полученной онтической плотности со стандартной кривой, полученной измереннем онтической плотности нескольких разведений, содержащих различные количества чистого цеаксантина.

Такой способ экстракции и измерения применяют для большого количества образцов подобной культуры. Выводят среднее арифметическое нолученных численных результатов. Количество цеаксантина, содержащегося в

клетках, или специфическую концентрацию также определяют, исходя из 5,16 мг на 1 г клеточной массы, что составляет получение цеаксантина в количестве 54,2 мг на 1 мл питательной среды. Точность этой оценки составляет около ± 3-5%.

В таблице приведено несколько примеров зависимости выхода цеаксантина от вида и количества добавляемого в культуральную среду вещества. Количества даны в г для со01ветствующей аминокислоты на 1 л среды н в молярной концентрации для соответствующего иона в среде.

Последовательность онераций во всех примерах такая же, как в примере 1. Добавление в среду серусодержащих аминокислот

и/или ионов двухвалентных металлов осуществляют неносредственно перед введением в нее инокулюма или перед стерилизацией среды. Числовые выражения продукции клеточной массы и цеаксантина приводятся с точностью до ± 3-5%. Они представляют собой среднее арифметическое значений, определенных для трех из десяти образцов данной культуры. В последних примерах несколько изменен

Формула изобретения

Способ получения цеаксантина, включающий культивирование продуцентов его микроорганизмов из рода Flavobacter на жидкой питательной среде, содержащей источники усвояемого углерода, свободные аминокислоты.

состав основной среды и природы инокулюма с тем, чтобы подтвердить, что эффективность способа зависит не от конкретного состава среды или одного удачно подобранного мутанта. Так, например, в примере 20 основная среда содержит 2% дрожжевого экстракта и 1% триптона, в примере 21-1% дрожжевого экстракта и 2% триптона и в примере 22 используемый мутант не такой, как в других примерах.

минеральные соли, микроэлементы и витамины, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода цеаксантнна, в питательную среду перед культивированием микроорганизмов дополнительно вводят серусодержащие аминокислоты, например цпстин, цистеин или метионин, в количестве не более 1 мг/мл ере7ды и микроэлементы в виде ионов двухвалентных металлов Fe++, Со+, Мо++, М.П++ в концентрации, равной 0,001-0,1 М. 8 Источник информации, принятый во внимание при экспертизе: 1. Патент Франции № 2099367, С 21d 5/00,