Способ получения зеаксантина Советский патент 1977 года по МПК C12D5/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЗЕАКСАНТИНА

Изобретение касается шособа псшучения якатого пигмента, именуемого зеаксавтином или 3,3 дигидрокси - Jj - каротина, путем культявировання микроорганизма, производящего это вещество.

Такой пигмент может быть использован, например, в качестве добавки в корм для кур с целью интенсифицирования желтой окраски их кожи дпя интенсифицирования окраски желтков ящ. Кроме того, зеаксантин можно применять в каэдстге красителя, например, в косметической промытленности.

Синтез пигмейтоа некоторыми микроорганизмами и, в частности синт езкаротиноидных пигментов бaктepня ш вида Flavobacter известен. Однако промышленное производство зтих пигментов путем биосинтеза представляется обычно тонким делом и достигаемые выходы малы и для получения существенных количеств пигмента приходится прибегать к очень большому количеству срер, для культивирования.

Изобретение относится к получению зеаксантина путем биосинтеза простым способом с повышением выхода пигмента. Изобретение касается способа получения зеаксантина путем культивирования производящего этот пигмент микроорганизма вида Flavobacter, при котсфом микроорганизм культивируют в питательной среда до получения клеток на стадии роста производств зеаксантина, после чего эти клетки культивируют орт температуре 22- 25° С в условиях достаточного насьпцешгя кислородом в ферментационной питательной q)eдe, содержащей не менее 25-35 мг/мл угг лерода, являющегося источником усвояемого углерода, источник ассимилируемого аминированно го азота, содержащего свободные аминированкыв кислоты; содержание зтих веществ поддерживают примерно в постоянном отношении, постепенно вводя их в процессе культивирования в ферме тадионную среду, причем культивирование продолжают до накопления в среде достаточного-количества зеаксашина.

Микроорганизм вида Ftavobacter представляет собой микроорганизм, избранный среди бакретиА зтогр вида, или мутант подобного микроорганизма. Выражение в условиях достаточного насыщения кислородом означает, что содержание кислорода в культивируемой среде никогда не опускается ниже порогового значетш, ниже которого оно становится фактором, ограш1чивающим степень роста микроорганизмов в условиях культивирования.

Условия достаточного насыщения кислородом могут быть| например, обеспечены нродуванием возгуха и энергичным размешиванием культивируемой среды. Питателыая означает среду культивирования, содержащую вещества, необходимыв для жизнедеятельности микроорганизма ими всшмилируемые; Среди таких веществ можно назвать источники углерода, азота и минеральные соли. Однако питательная среда может содержать и иные веп ества - витамины, факторы роста и микроэлементы.

Согласно изобретению гЛовят культуру микроорганизма вида Fiavobacter, которую потом инокулируют в питательную среду, помепданную в ферментер и со держанную в качестве источника усвояемых микрооргашзмамй углерода и азота. Рост микроорганизмов в ферментере поддерживают путем достаточного насыщения среды кульйширования кислородом и поддержаю1ем надЛежащей температуры - порядка 18 и 30° С и соответ ствующего рН.

Когда культура вступИт в фазу экспоненциального роста и клетки достигнут С1.4ШН производства зеаксантина (легко обшруживающую, бтагодаря желтой окраске этого пигмента), культивирование клеток продолжают в условиях достаточнш-о насыщения, кислородом при те&отературе от 22 до 25° С в водной питательной среде, содержащей от 15 до 35 мг/мл хотя бы одного .углевода н источник усвояемого аминировагшого азота, содерхшщего свободные аминокислоты, причем неизменное соотнощение соответствуювдйх количеств обеспечивается последовательной добавкой обоих веществ в питательную феду.

Углевод, который является основным источНИКОМ усвояемого микроорганизмом углерода, может избираться среди таких веществ как глюкоза, лактоза и сахароза. Основным источником усвояемого углерода может также быть смесь этах веществ.

Среди веществ, приемлемых в качестве компонентов основного источника аминного азота, можно указать, например, настой от вымачивания кукурузы, зкстракт дрожжей, гидролизаты протеина, в частности продукты, полученные при кислотном или ферментативном гидролизе протеинов растительного происхождения, например протеины сои или арахиса и/ю1И гидролизат казеина (трилтон). Этот источник аминного азота может также содержать вещество, приготовленное путем кислотного или ф- рментативного гидролиза биомассы, вьщеленной в качестве побочного продукта биосинтеза каротиноидного пигмента при культивиpOBai-ти бактерии вида Fiavobacter, в частности путем гидролиза биомассы Fiavobacter, культивирсванной с целью получения зеаксантина, из кото. рой пигме1п уже выделен.

Затем культивирован} ; продолжают в этих условиях в течение време}ш, достаточного для получения в культивируемой среде значительного

количества зеаксантина, содержащегося в клетках пигмента. К концу зтого периода можно прекратить добавление источников углерода и азота, дав композиции культивируемой среды развиваться по мере потребления микроорганизмами ннтатепьных вешрств.

Во время ферментации рН культивируемой среды регулируется в пределах 6,5-8,0, предпочтительно между 7,0 и 7,5. Регулирование рН может бьггь обеспечено с помощью щелочных растворов, например водных растворов едкого натра, едкого

кали или гидроокиси аммония или с помощью струи аммиака, предоочтительны два последних вещества, поскольку они одновременйо - источники ассимилируемого микроорганизмами аминного азота.

Затем зто культивирование продолжают в течение времени, достаточном для образования -в среде значительного количества зеаксяита. Купьтивировалие можно продолжать и после прекращения добавзюния питательных веществ.

Иослючительно интересные результаты получены при описанном выще культивировании в случае воздействия 1 - метил - 1 - нитро - 1 - нитрозогуандина (МННГ) на некоторые бактерии вида Fiavobacter по способу мутации, заключающемуся в том, что воздействие МННГ на бактерии проводят в отвержденной среде.

Согласно специальной форме осуществления зтого способа мутации готовят культуру бактерии вида Fiavobacter, производящей зеаксантин.

Эту культуру разбавляют в стерильном физиологическом растворю и полученный раствор потом смещивают в надлежащем отнощении в чаппсе Петри с водным раствором МННГ, например с эквивалентным объемом водного раствора МННГ, содержаищм 1-10 мг этого вещества на 1 мль Затем в полученный раствор выливают расплавленньШ агар, который тщательно смешивают с раствором. После затвердевания агара полученную твердую среду поддерживают при температуре инкубации 25-28° С до появления в среде колоний. Колонии затем забирают и несколько раз подряд пересаживают на твердые питательные подложки.

МутантНый микроорганизм может стать объектом одной или нескольких исследующих операций мутации в затвердевшей среде.

Результаты экспериментов показали, что мутация, осуществленная в затвердевщей С)реде с помощью мутагенного агента позволяет получить из бактерий вида Fiavobacter мутанты, произво)11дацие в идентичных условиях культивирования зеаксантин в количестве, шмного превосходящем результаты действия мутантов, полученных при обычных способах мутации из тех же бактерий и с помошью того же мутагенного агента.

Результаты экспериментов показали, что при культивировании мокроорганизма предлагаемым способом производство зеаксантина намного превышает выход его из культуры того же микроорганизма, но при обычно практикуемых условиях. После концентрирования бульона культуры экстрагируют из клеток зеаксантин с помощью полярного органического растворителя, например адатона, этилового спирта или хлорирсдааниого растворителя, например хлороформа.

Сепарирование биомассы из культуры можно осуществить, например, центрифугированием, декантацией или фильтрованием. Биомасса может использоваться в качестве добавки к корму для кур, или может быть подвержена экстрагированию с помощью полярного органического растворителя. Пример 1. Готовят начальную культуру вида Flavobacter (АТСС № 21588), которую пересаживают в количестве 5 об.% в находящуюся в ферментере водную питательную среду. Питательная среда, предварительно простерилизованная в течение 40 мин. при 120° С и потом охлажденная до 28 С, рН регулируемьпй с помощью аммиака в даапазЬне 6,9-7,1 имела следующий состав,%: Глюкоза (отдельно стерилизованная в концентрированном растворе)7,0

Настой от вь1мачива1шя кукурузы 1,6 Гидролиэат казеина (триптон) 0,8 Экстракт дрожжей1,8

Сернокислый магний0,5

Кукурузное масло0,08

Вода вод(Я1роводнаяДо 100

Микроорганизм культивируется в ферментере 1ФИ 28° С продуванием воздуха при энергичном размеишвании с непрерьшным регулированием рН в диапазоне 7,2-7,3 путем систематитеского добавления разбавленного водного раствора аммиака.

Осуществленная в таких условиях культура обладает 6-7-часовой латентной фазой, производство зеаксантина начинается через 14 час культивирования.

Когда содержание глюкозы в ферметационной среде достигнет, уменьшаясь 25 кг/мл; т.е. через 24 час после начала культивирования, температуру среды доводят до 24° Сив ферментер постепенно вводят питательный субстрат, пред аоительно простереяизованньш в отдельном сосуде так, чтобы содержание глюкозы было постоянным. Состав питательного субстрата,%:

Глюкоза32

Настой от намачивания кукурузы4,7

Гидро.изаг казеина (тоиптон)4,3

Экстракт дрожжей5,5

Вода водопроводнаяДо 100

рН7,7

Постепенную добавку состава продолжают в течение 20 Ч1:, причем температура поддерживается 244.

После суммарного культивирования в течение 50 час измеряют содержавшем зеаксантина в культуральной среде. Для этого биомассу отделяют от питательг го субстрата путем центриф.-ировання и

зеакгангин экстрапфуют из клеток ацетоном. Раствор зеаксантина в ацетоне определяют путем колорометрического сопоставления с титрованными растворами синтетического зеаксантина в том же растворителе.

Изькренное таким образом содержание зеаксантина в ферментационной среде составило 20 мкг/мл.

Дд1. сравнения, также начальная культура выращквалась обш пр1шятым способом. С этой целью ею инокулировали 5.об.% в таком же количестве предварительно простерилизованной jf охлажденной до 28° С питательно.; среды рН, регулировавшемся в пределах 6,9-7,1. Композиция имела следующий

состав,%:

Глюкоза10,0

Настой от вымачивани; кукурузы1,85

Гидролизат казеина (трштточ)1,25

Экстракт дрожжей2,1

Еернокисльй магшй0,5

Кукурузное масло0,08

Вода водопроводнаяДо 1000

Культипвирование проводилось с размешнваfffleM при энергичном продувании воздуха с непрерьшным регулированием рН до уровня 7,2-7,3. Д1штельность латентной фазы 8 час. Получение зеаксантина начиналось через 15 час. Температура среды поддерживалась спустя 24 час с начала кул

тивирования на уровне 24° С. Через 55 час после начала культивирования содержание зеаксантина в ферментационной среде (определенное вышеуказанным образам) равнялась 12 мкг/мл.

Пример2, Культуру вида Flavobacter (АТСС

fP 21081) готовят в водной питательной среде (с рН поддерживавшемся на уровне 6,5), имевшей следующий состав,%: Глюкоза3,0

Экстракт дрожжей1,0

Гидролизат казеина (триптон)1,0

Сернокислый магний0,5

Г ада водолроводнаяДо 100

Культуру, содержащую 5 г клеток -микроорганизмов на 1 л питательной среды, разбавляют в

отношении 1:10 (по объему), путем ряда последовательных операций, в физиологическог. стерильном растворе, содержащем 0,9 вес.% хлористого натрия. Затем тщательно смешивают 1 мл этого

раствора с 1 мл водного раствора МННГ, содержащего 5 мг/мл этого вещества в чашке Петри. Потом 1Ш приготовленный таким образом iраствор- выливают 10мл агара и производяттщательное смешивание агара с раствором. После затвердения

агара чв жу Петри инкуСируют при температуре порядка 25-28° С до появления в отвержденной среде колоний, т.е. через двое-четверо суток. Затем колонии отбирают из ташки Петри и помещают (путем ряда последовательных операщш) на питательные агаровые подложки в отсутствии МННГ.: Полученный мутант потом инокулируют в количестве 5 о6.% в 100 мл стерильной питательной Cf9ffti рН, поддерживаемым на уровне 6,5, имеющей следующий состав,%: Глюкоза3,0 Экстракт дрожжей1,0 ГЬдролизат казеинд (триптон)1,0 Оернокиспый магний1,0 Вода водсяроводнаяДо 100 Микроорганизм культивируют в этой среде при 28° С в аэробдасс условиях в Tewime 24 час, потом эта куяьтура вновь переносится в 2л нитательноа срека такого хвз состава. Спустя 24 час фврменавауан осущесталенвюй в тех же условиях, кубатуре веревюсятся 5об.% в иаходящун)ся в ферментере питатедизую среду. Шггательиая среда, предварительно простершгазованная в течение 40 мин П{Ж и охлажданвая до 20° С рН регулируемым аьолиаком на уровне 6,9-7,1, имеет следукшос соспш,%: Глюкоза (предварительно простерилизованная в концентрированном растворе)7,0 Настой от вымашваЁшг кукурузы1,0 Гидролнзат калена (трш1тон)0,8 %сстракт дрожяеей1,8 Сернокислый ,S Кукурузное масло0,08 Вопа водопроводнаяДо 100 Культивирование произвохугт в фе нлентере при 28° С с аэ1 фова1тем, энергичным размешиванием и автокетшюским регу1ВфоваШ1ем рН среды на уровне 7,2-7,3. Длительность татентнш фазы 5-6 час, о6разова гше зваксантина ш%нается через 12 час после начала культивирования. Когда содержание глкжозы в этсж культуре достигнет, уменьшаясь, 25 кг/мл, т.е. через 22 час после качала кулынвировання температуру среды доводят до 24° С, и в нее с таким расчетом, чтобы сохранить примерно постоянный уровень содержания глюкозы, вводят, предаарительно простерилизованный питательный субстрат, рН которого регулируется на уровне 7,2, имеющий следующий состав,%: Глнжоза32 Настой от намачивания кукурузы4,7 Гидролизат казеина (триптон)4,3 Экстракт дрожжей4,5 Вода водопроводнаяДо 100 Состав вводят постепенно в течение 20 час, причем температуру среды поддерживают на уровне 24° С. После суммарного культивирования в течение 48 час концентрация глюкозы в среде достегает 6 мг/мл, а содержание зеаксантина, измеренное . описанным в примере 1 способом, составляет 335 мкг/MJi. Пример 3. Описанным в примере 2 образом готовят мутант Flavobacter (АТСС 21081). Мутант инокулируют в 4 об.% в водную, предарительно простерилизованную в течение 40 мин ри 120° С, питательную среду и охлажденную до 28° С и помещают в ферментер. Эта питательная среда с рН регутшруемым с помощью аммиака, в пределах 6,9-7,1 имеет следующий состав,%: Глкнсоза7,8 Настой от вымачивания кукурузы1,8 Гидролизат жмыха0,7 Экстракт дрожжей2,0 Сершжнсльш магний0,5 Кукурузное масло0,08 Вода вощягроводваяДо 1QO Мжрооргавазм культдав1вдтот в фермен1ат рв 1ФИ 2:8° С, как описано в примере 2. После того, как содерхонве глюкозы в яреде достигнет 25 мг/мл, температуру среды дсшодят рю 24 Сив нее постеоенноУ что обеспешть примеряо оостоянный уровень содержания глюкозы, вводят вредаа1ште1аво просте нигазованный питательш)1й субстрат, с рН регулируемым на уровш 7,2% оюдукяцего состава,%: Dmaco3a12 от вымачивания кукурузы4,7 Гащюлизат жмыха арахиса3,5 страк дрожжей6,0 Вода водрар(юодааяДо 100 осуществлять в течевЕие 20 час при температуре 24° С. Спустя 51 час общего кульгавирования, содержание гакисозы в среде доходит до 7,5 мг/мл. Содержаиш зеаксантшга, определенное по описанному в примере 1 , равняется 312 мкг/мл. Пример 4. Приготовленную культуру бактерии Flavobacterium aguatile (АТСС № 11974) инокулируют в находящуюся в ферментере питательную среду. Это предварительно простерилизованная в течение 40 мин при температуре 120С5 охлажденная до 28° С водная питательная среда, { которой поддерживается аммиаком на уровне 6,9-7,1, идентичная питательной среде, описанной в примере 1. Культивируемый в ферментере в тех же условиях температуры рН и продувания воздуха, как в примере 1, микроорганизм обладает 6-7-часовой латентной фазой и начинает производить зеаксантин через 14 час от начала культивирования. -Когда содержание глюкозыв ферментационной среде достигнет, постепенно уменьшаясь, 25 мг/мл, т.е. спустя 24 час после начала культивирования температуру устанавливают на уровне 24° С и в ферментер вводят, предварительно простерилизованный в отдельном сосуде питательный субстрат с рН, .регулируемым на уровне 7,2. Состав субстрата аналогичен составу субстрата, описанному в примере 1. Субстрат вводится в фермеитер с расчетом на сохранение постоянного уровня содержания глюкозы в среде (25 мг/мл) в течение 20 час. Температура среды поддерживается на 24° с.

Спустя 50 час суммарного культивирования содержание зеаксантина в ферментациокмой среде определяют хромагрифированием в тонком слое и ультрафиолетовой спектроскопией.

Содержание зеаксантина в ферментационной среде пря таких методах измерения 16 мкг/мл.

Для сравнения бактерия культивировалась обычным образом (списанным, также для сравнения в примере 1). Через 55 час от начала культивирования содержание зеаксантина в ферментационной среде оказалось равным только 4 кжг/мл.

П р и м е р 5. Приготовлен по сшисашюму в примере 2 способу и при тех же самых условиях Flavobacteriufn aguatUe (ATCCN 11947).

Мутант культивировался затем в тех же питательных средах, с постепенным дoбaвлeJffieм того же питательного субстрата, как в примере 2, щжчем в тех же условиях.

Отустя 48 час суьвушрного культивирования концентрация глюкозы достагла 5 мкг/мл, а содержание зеаксантина в среде, измеренное аналогично описанному в примере 4, ргя«а 40 мг/мл.

Формула изобретения

рН 6,5-8,0.

кукурузы.

1,6:3,4 соответстеешю.

что зеаксактин выделяют из клеток путем эксграгироваш«я полярным растворителем.