Способ получения цеаксантина Советский патент 1977 года по МПК C12D5/00 A23K1/00 

Изобретение отиосится к споеобу получения цеаксантина микробиологическим путем.

Желтый пипмеит, называемый цеаксаитином или 3,3-диокси-р-каротином, может быть использован в качестве кормовой добавки для кур с целью усиления желтой окраски их кожИ или желтка яиц. Изучается возможность использования этого вещества в качестве красителя в косметической и пищевой промышленности.

Известен способ получения цеаксантина, включающий культивирование продуцентов его микроорганизмов рода Flavobacter на жидкой питательной среде, содержащей источиики усвояемого углерода, свободные аминокислоты, минеральные соли, микроэлементы и витамины 1.

Однако цромышлеиное получение этих пигментов путем биосинтеза является очень сложным и часто характеризуется низким выходом цеаксантииа со значительны расходом количества культуральпой среды, необходимой для получения больщих количеств иигмента. Для увеличения выхода цеаксантииа без существенного увеличения затрат иа его ироизводство по -предлагаемому способу в питательную среду, содержащую источники усвояемого углерода, свободные аминокислоты, минеральные соли, микроэлементы и витамины, дополнительно добавляют 0,1-

1 мг/мл среды пнридоксина (витамин Be) и микроэлементы в виде ионов двухвалентных металлов Fe++, Со+-, .Мо+, Мп++ в концентрации, равной 0,001-0,1 М, при этом дополнительно перед культивированием микроорганизмов в питательную среду вводят 100- 200 мкг/мл среды серусодержащих амииокислот, например метионин, шютеин, цистин. Выход цеаксантииа превыщает выход при использовании известных классических способов до 200%.

Увеличение выхода цеаксантина приводит, естественно, к значительному снижению издержек его нроизводства.

Для осуществления нредлагаемого сиособа в качестве источника ассимилируемого углерода используют 0,1 -15% от веса культуральной среды глюкозы или сахарозы, и в качестве ассимилирующего аминного азота - 0,1-8% от веса среды дрожжевого и/или кукурузного экстракта и/или гидролизата белков. В среду вводят также 0,1-2 вес. % сульфата -аагння. Приготовленную смесь веществ доводят водопроводной водой до 100 вес. %.

Для модификации в среду добавляют 0,1 - 1 мкг/мл, предпочтительно 0,1-0,3 мкг/мл ниридоксина.

В приготовленный таким образом иитательный раствор добавляют инокулюм микроорганизмов из рода Flavobacter, являющихся продуцентами цеаксаптииа. Ферментацию осуществляют при цостоянном перемешивании и аэрации при определенных значениях рН и температуре в течение времени, необходимого для получения значительного количества внутриклеточного цеаксантииа. В случае необходимости после концентрирования питательной среды, клеточный цеаксантин экстрагируют таким полярным органическим растворителем, как ацетон, этиловый спирт или хлороформ. Биомассу отделяют от культуральной среды путем центрифугирования, декантации или фнльтрацнн, и зааеы ее можно иснользовать или в качестве кормовой добавки для кур, или для получения экстракта в полярном органическо;М растворителе.

Таким образом, количества цеаксантина в биомассе постоянно увеличиваются до 10%, количество биомассы увеличивается до и продуцирование цеаксантина ио предлагаемому способу возрастает примерно на 30% по сравнению с классическим способом.

Подобное стимулирование продуцирования цеаксантина микроорганизмами из рода f-lavobacter происходит при добавлении в основной питательный раствор или ионов двухвалентных металлов Fe++, Со, Мо++, , или серусодержащих аминокислот метионина, цистина и цистеииа или смеси ионов металлов с серусодержащими аминокислотами. Продуцирование цеаксантина возрастает до 1507о по сравнению с выходом нри выращивании культуры такого же микроорганизма на классической питательной среде.

Согласно нредлагаемому способу состав среды изменяют добавлением ограниченных количеств ионов металлов Fe++, Со++, Мп++ Мо++, причем во избежание проявления ингибирования .концентрация вводимых в среду ионов Fe++ и/или Со++ и/или Мп++ и/или Мо++ не должна превыщать 0,2 М. Оптимальные концентрации 0,0006-0,1 М и наиболее предпочтительные 0,001-0,05 М. Ионы металлов можно вводить в виде таких хорошо растворимых солей, как сульфат железа или хлористое лселезо, хлористый кобальт, молибдат натрия, сульфат магния.

По предлагаемому способу состав среды изменяют также добавлением ограниченных количеств серусодержащих аминокислот, например метионина, цистина и цистеина или их смесей, причем их количества во избежание проявления ингибирования, не должны превышать 1 мкг/мл. Наиболее предпочтительное количество 100-200 мкг/мл. Для Введения в среду предночтительным ионом металла является Fe++, а предпочтительной аминокислотой - метионин.

Когда в среду добавляют указанные стимуляторы стимуляция продуцирования микроорганизмов из рода Mavobacter заметно увеличивается. Оба эффекта стимуляции усиливаются и П1роя-вляются в увеличении продукции цеаксантина примерно до 200% по

сравнению с выходом, получаемым при выращивании культуры этого микроорганизма на классической питательной среде. Прирост продукции, получаемый вследствие увеличеПИЯ концентрации цеаксантина в биомассе, превышает прирост вследствие увеличения только биомассы, который бывает не более 10%.

Пример 1. Готовят культуральную среду, состава, вес. %:

Глюкоза3

Гидролизат казеина

(триптон)1

Дрожжевой экстракт1

Сульфат магния0,5

Вода водопроводнаяДо 100.

Эту среду помещают во флакопы, стерилизуют нри 120°С в течение 20 мин, затем охлаждают до 25С, рН среды после стерилизации устанавливают 7,3. Вводят в среду инокулюм мутанта штамма АГСС .N 21ь88 из рода Flavobacter. Культуру этого микроорганизма выдерживают на среде в течение 48ч

при температуре 25°С, постоянно аэрируя ее нри вращении флаконов на специальных аппаратах со скоростью 200 об/мин. Затем флаконы центрифугируют и получают 10,3 г целевого продукта на 1 л питательной среды.

Количество цеаксантина, содержащегося в клетках, определяют экстракцией пигмента и последующим измерением оптической плотности экстракта. Для получения экстракта приготовляют суспензию клеток 0,5 мл водного

солевого раствора, затем добавляют равный объем ацетона, встряхивают несколько минут и фильтруют. Оптическую плотность фильтрата онределяют на спектрофотометре npt длине волны 450 нм. Количество цеаксантинопределяют, сравнивая полученную оптиче скую плотность со стандартной кривой, полученной измерением оптической плотности нескольких разведений, содержащих различные количества чистого цеаксантина.

Такой способ экстракции и измерения применяют для больщого количества образцов подобной культуры. Выводят среднее арифметическое полученных численных результатов. Количество цеаксантина, содержащегося в

клетках, или специфическую концентрацию, также определяют, исходя из 6,1 мг на 1 г клеточной массы, это составляет продукцию цеаксантина в количестве 62,4 мг на 1 мл п-итательной среды. Точность этой оценки составляет около ± .

В таблице приведено несколько примеров влияния вида добавляемых веществ на выход цеОКсантина. Количества указаны в мкг пиридоксина и/или соответствующей аминокислоты на 1 л среды и в молярной концентрации соответствующих ионов в мг на 1 мл питательной среды. Понятие «клеточная масса означает количество цеаксантина, содержащегося в полученных клетках в мг цеаксантина на 1 г целевого лродукта.